生化与分子生物学研究思路与技术陈汉春课件.pptVIP

生物化学:;一.生物化学研究的目的：;二.生物化学的研究对象：;三.生物化学研究的发展：;叙述生物化学(descriptive

biochemistry)阶段(1770～1903);我国人民在公元前二十一世纪，已用曲酿酒，称曲为酒母，又叫做酶；公元前十二世纪，已将豆、谷发酵，捣烂、加盐以造酱，并制出麦芽糖，当时称为“饴”。公元九世纪或十世纪已制成豆浆和豆腐。;2.动态生物化学(dynamicbiochemistry)阶段（1903～1950）;此阶段中国人民的贡献：;3.功能或分子生物化学（functional

ormolecularbiochemistry）阶段

（1950年至今）;此阶段中国人民的贡献：;四.生化研究的基本思路

和技术路线：;1.细胞器和生物分子的分离：;要了解生物分子的结构，首先必须得到纯化的生物分子。用于分离和纯化生物分子的方法很多，例如盐析法、层析法、凝胶过滤、电泳、超速离心等。要得到均一性的生物分子往往需要综合性采用多种方法。;亚细胞器/单位;2.生物分子的结构确定：;3.生物分子的功能和代谢分析：;;2）生物分子的代谢分析：;某些氨基酸、糖和脂肪酸可以与一个合适的稳定同位素结合，然后注入动物体内或用于体外实验来观测它们的代谢过程。这些研究证实代谢是一个很活跃的过程，细胞内大部分复合物都在不停地合成和降解。;五.分析生化反应的总体策略：;六.生化研究技术的进步：;1.细胞器及生物分子的分离与纯化：;基本技术：;1）匀浆:;使样品绕离心机转轴的中心旋转而获得一个

远大于地球重力的沉降应用力，样品介质中

不同大小、形状和密度的颗粒将以不同的速

度沉降。

影响因素:离心力(转速及颗粒与中心轴的

距离)，颗粒的大小、形状、密

度，介质的粘度。;低速离心:≤6000r/min、室温，

RCF(相对离心力)≤6000g。

高速离心:6000～25000r/min、低温，

RCF=6000～60000g。

超速离心:25000r/min、低温+真空，

RCF=60000～600000g。

差速离心:连续用几种递增的离心速率离心。

密度梯度离心:样品中不同组份在离心力场的

作用下停留于相应密度???支持物

层面。;根据样品中各组分物理生化特性、分子大小形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性或亲和性等的不同而将它们分离。

类型:

吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤、疏水相互作用层析、亲和层析、共价层析和金属螯合层析。

;常用层析法:;①薄层层析和纸层析:;②柱层析:;*;4）电泳：;电泳支持物:;电泳缓冲系统:;常用电泳技术:;①基本电泳:

纸电泳、醋纤膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、

聚丙烯酰胺凝胶电泳。

;*;②等电聚焦:

在pH梯度下进行。pH梯度由结构类似的小分子量两

性电解质形成，等电点(pI)在pH3～10之间。当存

在外加电场时，每一种两性电解质向其pI值处移动

而形成稳定的pH梯度。

电泳过程中每一种带电分子都朝自己的pI位置移动

而被分离。;③毛细管电泳:;④双向电泳;*;2Dgelinproteomics;点匹配结果:;2.生物分子的分离与纯化：;1）蛋白质纯化:;2）DNA提取:;基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱

M:λDNA/HindIII分子量标准，

泳道1～4分别代表4个不同样品的基因组DNA;3）RNA提取:;总RNA和mRNA的琼脂糖凝胶（1％）电泳图谱;七.生物分子的结构与功能分析：;分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成;通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列;2.酶活力检测:;3.蛋白质组学分析:;4.DNA序列分析:;5.聚合酶链反应（PCR）:;在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。;DNA-DNA

杂交双链分子;Southern印迹杂交:;Northern印迹杂交:;