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基因工程第一章核酸的制备;核酸：遗传信息的储存物质;第一节天然DNA的制备（PreparationofDNA）;主要碱基的化学结构：;结构：;DNA;DNA;解链温度（Tm，meltingpoint）;DNA分子杂交(HybridizationofDNAstrandsfromdifferentsources);0，EDTA1mmol/L）

要求：浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量

与细菌核蛋白体的30S亚单位结合，干扰核糖体上密码子与反密码子的相互作用，从而阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合，5mg/mL（乙醇溶液）；

标准的PCR反应条件：

反向PCR锚定PCR

方法：以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,

(5)7210

一次性加好反应液，2～4小时完成扩增

实时定量PCR多重PCR

开环DNA（opencircleDNA，oc-DNA）；

方法：对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

超螺旋DNA（supercoiledDNA，SC-DNA）；;二、天然DNA的提取（PurificationofDNA）;2.大肠杆菌（E.coli）常见抗生素（Antibiotics）的使用：

2.1氨苄青霉素（ampicillin，Ap）：

抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，50～150μg/mL（水溶液）；

2.2链霉素（streptomycin，Sm）：

与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质(酶)的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡，25～50μg/mL（水溶液）；

2.3四环素（tetracycline，Tc）：

与细菌核蛋白体的30S亚单位结合，干扰核糖体上密码子与反密码子的相互作用，从而阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合，5mg/mL（乙醇溶液）；

2.4氯霉素（chloramphenicol，Cm）：

与细菌核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成，20μg/mL（乙醇溶液）；

2.5卡那霉素（knamycin，Km）：

与细菌核蛋白体蛋白基结合，并与较小的RNA亚基编译区的特定碱基结合，从而抑制蛋白质合成，25～50μg/mL（水溶液）；

;(二)裂解细胞（Celllysis）：

1.化学方法：

1.1CTAB裂解法：

CTAB（cetyltriethyammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），阳离子去污剂，与核酸形成复合物，在高盐溶液（＞0.7mol/LNaCl）中稳定，在低盐溶液（≤0.3mol/LNaCl）中沉淀。

1.2SDS裂解法：

SDS（sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸钠），阴离子去垢剂，蛋白质变性剂，有效沉淀多糖，与K离子??成絮状沉淀，广泛用于质粒（plasmid）DNA的提取，蛋白质的分离纯化。

;2.酶裂解方法：

2.2蛋白酶K（ProteinaseK）裂解法：

用于水解蛋白质，特别是与DNA结合紧密的组蛋白（Histone），广泛用于动物组织基因组DNA的提取，通常与SDS，Tris-Cl及EDTA共同裂解细胞。

2.3溶菌酶（lysozyme）裂解法：

通常用于细菌裂解，提取质粒DNA，其原理是破坏细菌细胞壁的肽聚糖支架，通过低渗透压使细胞胀裂，引起细胞裂解。作用条件温和，pH6.0～7.0，室温25℃。;（三）DNA的分离和抽提;2.氯化铯密度梯度离心法(CsCldensitygradientcentrifugation)；

3.固相萃取法(solidphaseextraction,SPE)；

;离心技术在基因工程中的应用（ApplicationofCentrifugationtechniques）;（四）DNA的纯化（purification）和浓缩（condense）;琼脂糖电泳（Agarosegelelectrophoresis）;2.琼脂糖凝胶浇灌并冷凝;3.移走梳子，暴露出上样孔;4.琼脂糖胶放置在电泳缓冲液中;5.上样，通电流，直至DNA迁移到适当位置;6.在紫外光（UV）下观察DNA电泳情况;DNA电泳完毕后的琼脂糖凝胶;在紫外光（UV）下观察DNA电泳情况;不同凝胶的DNA电泳情况;电泳仪（电源和电泳槽）;离子交换柱层析纯化DNA;2.DNA的浓缩：

2.1乙醇（Ethanol）沉淀法；

2.2正丁醇（butylalcohol）抽提法；

2.3聚乙二醇（PEG6000）浓缩法；;第三节人工合成核酸片段;PCR技术简史;PCR