基因重组技术概述.pptVIP

7.II型限制酶的用途

（1）DNA重组克隆及亚克隆

（2）DNA杂交与序列分析

（3）改建质粒

（4）构建基因组DNA物理图谱和文库等

第30页，共63页，星期日，2025年，2月5日（二）DNA聚合酶

1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）

（1）大肠杆菌DNA聚合酶I

特性：具有3种酶活性第31页，共63页，星期日，2025年，2月5日5’3’外切功能3’5’外切功能聚合酶功能第32页，共63页，星期日，2025年，2月5日5’CCG3’GGCTATCGA5’聚合酶dATPdTTPdGTPdCTP5’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGA5’a.5’?3’DNA聚合酶活性

底物：单链DNA模板及带3’羟基的DNA引物第33页，共63页，星期日，2025年，2月5日5’CCG3’3’GGC5’聚合酶5’CCGATAGCT3’3’GGC5’ATAGCTb.3’?5’外切酶活性

底物：

带3’羟基的双链DNA或单链DNA、从3’羟基端降解DNA。对双链DNA链的外切核酸酶活性可被5’?3’DNA聚合酶活性所封闭。第34页，共63页，星期日，2025年，2月5日c.5’?3’外切酶活性：

能从游离的5’末端降解DNA成为单核苷酸。5’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGAAT5’聚合酶5’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGA5’TATA第35页，共63页，星期日，2025年，2月5日（2）Klenow片段

从大肠杆菌DNA聚合酶I中去除5’?3’外切酶活性，即得Klenow片段。

其只具有5’?3’聚合酶活性

3’?5’外切酶活性第36页，共63页，星期日，2025年，2月5日

35kD76kD苦草杆菌蛋白酶裂解全酶5’3’外切酶5’3’聚合酶3’5’外切酶5’3’聚合酶3’5’外切酶Klenow片段DNA聚合酶I全酶第37页，共63页，星期日，2025年，2月5日应用

1.催化DNA切口平移反应，置备高比活DNA探针。(大肠杆菌DNA聚合酶I）DNaseIDNA聚合酶IdNTP32P-dNTP第38页，共63页，星期日，2025年，2月5日2.对DNA分子进行末端标记（Klenow）第39页，共63页，星期日，2025年，2月5日2.TaqDNA聚合酶

(1)特性：

①耐热的DNA聚合酶

来自于嗜热的栖热水生菌Thermusaquaticus

中纯化而来的。

②5’?3’聚合酶活性

③5’?3’外切酶活性

④最佳作用温度为75-80?C（2）用途

①通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增

②对DNA进行测序第40页，共63页，星期日，2025年，2月5日3.反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）

（1）特性

①催化从RNA为模板的DNA聚合反应

②具3’?5’RNA外切酶活性，能特异性降解RNA—DNA杂交分子中的RNA部分

③具DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）的功能

④能以mRNA为模板催化合成出互补的DNA（cDNA）

第41页，共63页，星期日，2025年，2月5日（2）分类

①禽源反转录酶

来自禽或骨髓细胞瘤病毒（AMV）

具有聚合酶活性及强的RNA酶H活性

无3’?5’外切酶活性。

温度42?C

pH8.6时活性较高第42页，共63页，星期日，2025年，2月5日②鼠源反转录酶

来自Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）

具有聚合酶活性及相对较弱的RNA酶H活性无3’?5’外切酶活性

温度37?C

pH7.6时活性较高

第43页，共63页，星期日，2025年，2月5日第44页，共63页，星期日，2025年，2月5日第45页，共63页，星期日，2025年，2月5日基因重组技术概述第1页，共63页，星期日，2025年，2月5