整合Iso-Seq和RNA-seq揭示SiO2胁迫下小鼠肺纤维化过程中可变剪接的动态变化.pdfVIP

摘要

尘肺病是由于长期暴露于高浓度粉尘环境中，吸入的工业粉尘颗粒在肺部累

积造成的肺组织纤维化疾病。目前尘肺病在全球的发病规模较大，在一些发展中

国家和地区仍然是亟待解决的公共卫生问题。研究证明疾病的发生与某些基因的

可变剪接存在紧密联系，但从可变剪接角度解析纤维化发病机制的研究仍然较为

匮乏。为明确尘肺病发病过程中可变剪接的调控作用，本文采取PM2.5自然吸

入式暴露系统构建小鼠肺部纤维化模型，通过RNA-seq数据定量后的表达量校

正获得高置信度的差异表达基因及差异可变剪接事件，同时利用Iso-Seq转录组

测序获得全长剪接变体，进一步与RNA-seq数据进行联合分析，挖掘尘肺病发

病过程中的关键差异可变剪接事件，并结合文献报道探究其调控机制，希望能够

从可变剪接的角度探索尘肺病的发病机理，具体研究结果如下：

1.利用PM2.5自然吸入式暴露系统构建小鼠肺部纤维化模型。取空白对照

组（（NT）和二氧化硅（（SiO）处理组（（PF）小鼠肺组织及血清样本，通过病理学

2

观察、生化指标检测等方法对模型构建效果进行评估。结果表明：吸入二氧化硅

粉尘后会导致肺组织产生炎症及纤维化。HE染色结果显示随着染尘时间的增长

肺泡结构出现塌陷，肺间质增厚，并伴随出血现象，出现纤维化斑块；Masson染

色结果显示随着染尘时间的增长蓝染面积逐渐增大，胶原物质累积增多；炎症因

子IL-6、TGF-β、TNF-α含量较空白对照组均有显著上升（p0.01），随着染尘时

间的增长炎症反应加剧；氧化应激因子SOD含量较空白对照组显著下降（p0.0

1），ROS和MDA含量较空白对照组显著升高（p0.01）；胶原基因及HYP的表

达量均显著增加（p0.01）。

2.RNA-seq数据分析。选取SiO2处理组及空白组小鼠肺组织进行RNA-seq

测序，TPM定量后采用T-test再次对基因表达水平进行二次校正，通过标准差分

析及差异分析对校正结果进行评估。结果表明：经过校正，对照组及实验组样本

整体数据离异程度降低，样本聚类效果增强。（（1）基因表达分析结果显示有18516

个基因的表达量数值至少有一个被校正，占所有表达基因的96.9％；数据校正后

新识别到差异表达基因571个；聚类结果显示对照组和实验组聚类簇差异明显，

组内重复样本聚类紧密型增强；富集分析显示差异表达基因主要与免疫应答、炎

症反应调控、细胞因子互作、炎症反应、ECM过程调控、趋化因子结合、细胞

周期调控等功能及通路相关。（（2）可变剪接事件分析结果显示，对跨过剪切位点

的reads（（junctionreads）过低的事件过滤后，共筛除低置信度事件2605个，20472

个事件中的样本PSI数据信息被校正，最终得到高置信度的事件30073个，识别

到991个显著的差异可变剪接事件。

3.Iso-Seq及RNA-seq数据整合分析。同时选取SiO2处理组及空白组小鼠

肺组织进行Iso-Seq测序，对测序数据进行统计分析，采用AStalavista软件识别

可变剪接事件，根据对照组（NT）和二氧化硅处理组（PF）中可变剪接事件的

发生的有无进行差异可变剪接事件识别；进一步整合分析Iso-Seq和RNA-seq中

的可变剪接事件，进行分类分析。结果表明：通过SMRT对两组小鼠肺组织样品

测序，NT及PF组分别获个原始序列（subreads），产

生1094767、988066条CCS序列，901019和802041个被鉴定为全长非嵌合序

列（FLNC）；NT及PF组分别识别到80747和61930个可变剪接事件，A3SS事

件占比最高（NT:56%；PF:53%），共检测到差异可变剪接事件120314个，类型

最多的A3SS（57％）；Iso-Seq和RNA-seq联合分析结果显示，使用Iso-Seq共

识别到了115981个新的可变剪接事件，二代已经注释到的事件有7734个；两者

的差异可变剪接事件整合比对结果显示，检测到二代三代数据中均为差异的可变

剪接事件244个、三代发现差异而二代非差异的可变剪接事件119297个、三代

非