玉米赤霉烯酮免疫磁珠净化及分析方法研究.pdfVIP

摘要

玉米赤霉烯酮是一种常见的真菌毒素，对人体健康有潜在的危害。因此，建立一

种高效的样品前处理方法及准确的检测方法对于保障食品安全具有重要意义。本研究

制备了可特异性识别玉米赤霉烯酮（ZEN）的单克隆抗体，并建立了间接竞争酶联免

疫分析（ELISA）方法和免疫磁珠富集净化方法，并利用分子模拟、分子对接技术对

抗体识别ZEN的分子机制进行初步探究。

本实验通过羧甲基羟胺法合成玉米赤霉烯酮半抗原（ZEN-CMO），采用碳二亚胺

法偶联牛血清白蛋白（BSA）合成玉米赤霉烯酮免疫原（ZEN-CMO-BSA）用于免疫

Balb/C小鼠。经过细胞融合与筛选及克隆化，得到5G3、4B6两株杂交瘤细胞株。选

择对ZEN最灵敏的细胞株5G3建立了间接竞争酶联免疫分析方法（ic-ELISA），经优

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化的最佳实验条件为：包被抗原浓度为0.5μg/mL，抗体稀释6.4×10倍，0.5%脱脂

乳粉封闭，采用pH为7.4的0.01mol/L的PBS缓冲液稀释ZEN标准品与抗体。该方

法的灵敏度（IC50）为0.37±0.04μg/L，检出限（IC15）为0.05±0.01μg/L，线性范围

（IC20—IC80）为0.08—1.45μg/L。

随后，使用5G3株抗体偶联磁珠，最佳偶联条件为：在0.1mol/LMES（含0.5

mol/LNaCl，pH=4.8）中，抗体添加量为90μg/mg磁珠，偶联时间为2h，封闭液为

0.01mol/L的PBS（含有1%BSA），封闭时长为1h。并建立了免疫磁珠富集净化方

法。免疫磁珠富集净化最佳条件是：甲醇含量为5%时，在pH为7.4的0.01mol/LPBS

中富集5min，使用0.5mL甲醇洗脱1min，回收率为94.29±0.5%。随后使用谷物及

其发酵制品、饮料、食用植物油三大类11种ZEN空白食品基质，评价了经免疫磁珠

净化后洗脱液的基质效应值，该方法基质效应值在0.95—1.02之间，说明该富集净化

方法可以较好的消除基质效应。使用上述11种食品基质进行添加回收试验，间接竞

争ELISA方法的添加回收率在72.85±5.90%—111.71±13.25%之间，平均回收率为94.92

±9.26%。

使用免疫磁珠富集净化市售玉米油样品，使用间接竞争ELISA方法测定，液相色

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谱串联质谱法进行验证，两者相关性良好，相关系数R=0.99，进一步说明所建立的

免疫磁珠富集净化方法的可行性以及间接竞争ELISA方法的准确性。

构建了5G3株抗体可变区三维模型，评估模型合理性后使用Autodock对ZEN及

其结构类似物进行分子对接。结果表明抗原抗体反应中主要存在氢键和疏水相互作用

两种作用力，抗体H链可变区的Trp47可能是与ZEN及其结构类似物形成氢键的关

键氨基酸位点，L链为疏水相互作用提供了关键氨基酸。

关键词：玉米赤霉烯酮；单克隆抗体；酶联免疫分析方法；免疫磁珠；分子对接

ABSTRACT

Zearalenoneisacommonfungaltoxinthatispotentiallyharmfultohumanhealth.

Therefore,itisimportanttoestablishanefficientsamplepretreatmentmethodandan

accuratedetectionmethodtoensurefoodsafety.Inthisstudy,monoclonalantibodiesthat

specificallyrecognizezearalenone(ZEN)wereprepared,andanin