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细菌回复突变试验方法

BacterialReverseMutationTest

1范围

本方法确定了细菌回复突变试验的基本原则、要求和方法。

本方法适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。

2定义

2.1回复突变reversemutation

细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型（prototroph）。

2.2基因突变genemutation

在化学致突变物作用下DNA中碱基对的排列顺序发生变化。

2.3碱基置换突变basesubstitutionmutation

引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。

碱基置换有转换（transition）和颠换（transversion）两种形式。

转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。

颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。

2.4移码突变frameshiftmutation

引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。

2.5细菌回复突变试验bacterialreversemutationassay

利用一组组氨酸或者色氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型回复突变为原养型的试验方法。

3原理

鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；大肠杆菌色氨酸营养缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。

某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。

4仪器和设备

培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱（-80℃）或液氮生物容器、普通冰箱、天平、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机、玻璃器皿、生物安全柜等。

5培养基和试剂

5.10.5mmol/L组氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液

成分：

L-组氨酸（MW155）

78mg

D-生物素（MW244）

122mg

L-色氨酸（MW204）

102mg

加蒸馏水/去离子水至

1000mL

配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。储存于4℃冰箱。若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸。

5.2顶层琼脂培养基

成分：

琼脂粉

1.2g

氯化钠

1.0g

加蒸馏水/去离子水至

200mL

配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。试验时，加入0.5mmol/L组氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液20mL。若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸。

5.3Vogel-Bonner（V-B）培养基E

成分：

枸橼酸（C6H8O7·H2O）

100g

磷酸氢二钾（K2HPO4）

500g

磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O）

175g

硫酸镁（MgSO4·7H2O）

10g

加蒸馏水/去离子水至

1000mL

配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水/去离子水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储存于4℃冰箱。

5.420%葡萄糖溶液

成分：

葡萄糖

200g

加蒸馏水/去离子水至

1000mL

配制：加少量蒸馏水/去离子水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水/去离子水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储存于4℃冰箱。

5.5底层琼脂培养基

成分：

琼脂粉

7.5g

蒸馏水/去离子水

480mL

V-B培养基E

10mL

20%葡萄糖溶液

10mL

配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备用。

5.6营养肉汤培养基

成分：

牛肉膏

2.5g

胰胨

5.0g

磷酸氢二钾（K2HPO4）

1.0g

加蒸馏水/去离子水至

500mL

配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储存于4℃冰箱。

5.7盐溶液（1.65mol/LKCl+0.4mol/LMgCl2）

成分：

氯化钾（KCl）

61.5g

氯化镁（MgCl2·6H2O）

40.7g

加蒸馏水/去离子水至

500mL

配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭