DBS22 020-2013 食品安全地方标准 动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法.docxVIP

DBS22

吉林省地方标准

DBS22/020—2013

食品安全地方标准

动物源性食品中沙门菌

环介导等温扩增（LAMP）检测方法

2013-12-31发布2013-12-31实施

吉林省卫生和计划生育委员会发布

I

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前言

本标准的附录A是资料性附录。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。

本标准起草人：邵洪泽、王楠、苏双、石春军、刘芳、邢国明、李文东、程荣华、蒋云岩、白翠、许尧、李佳桐。

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吉林省食品安全地方标准

动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法

1警告

使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

2范围

本标准适用于肉、蛋、奶等动物源性食品中沙门菌的筛选检测。

3规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验

GB19489-2008实验室生物安全通用要求

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测

4技术概要

根据沙门菌属特有的靶序列肠毒素基因序列，设计2对特殊的内、外引物（内引物FIP与BIP，外引物F3与B3），特异性识别靶序列上的六个独立区域，为增加反应速度，还设计1对环引物（LF与LB）。利用Bst酶启动循环链置换反应，在肠毒素基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。

5引物与试剂

5.1特异性引物

根据沙门菌的肠毒素基因，设计LAMP检测引物，序列见表1。

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表1特异性引物浓度及序列

引物种类

引物名称

核苷酸序列

外引物

F3

B3

5-CCTTTCCCGCTATCGGTAAC-35-GGATGCCCAAAGCAGAGAG-3

内引物

FIP

BIP

5-GGCCGCCAGGGAACGATTAG-TGATGATAACGCGGTCGGT-35-TTCAACAGCACCTGAGTCAGCC-TTCACGGCGAATGAGACG-3

环引物

LF

LB

5-CGTAGAGGCAAAAGAAAGTGGG-35-TGTCCGGGTCAGCCTGA-3

5.2试剂

5.2.1增菌液

——缓冲蛋白胨水（BPW）增菌液，见GB4789.4—2010中A.1。

——四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，见GB4789.4—2010中A.2。

——亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液，见GB4789.4—2010中A.3。

5.2.2LAMP试剂

——10×BstDNA聚合酶缓冲液（200mmol/LTris-HCl，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1%Triton-100，pH8.8，25℃);

——25mmol/LMgCl2；

——10mmol/LdNTP混合物；

——8U/μLBstDNA聚合酶；

——5mol/LBetaine；——灭菌双蒸水。

5.2.3其他试剂

——SYBRGreenI染料，1000×。

6仪器

6.1生物安全柜；

6.2高速离心机：5000r/min-16000r/min；

6.3水浴锅：65±1℃,100℃±1℃;

6.4微量加样器：量程1μL-20μL；量程200μL-1000μL；

6.5细菌培养用仪器：见GB4789.4—2010。

7操作程序

7.1样品前处理

按GB4789.4—2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验中5.1操作。

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7.2增菌培养

按