蛋白质的分离、纯化和表征.ppt

蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性

碱/酸越大——pI越大;二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀;蛋白质胶体溶液的稳定因素：

1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥

2.水膜弹性

蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质;（二）蛋白质的沉淀

Pr从胶体溶液中析出

Ⅰ可逆沉淀：

温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷

Pr结构和性质没有变化

适当条件下可重新溶解

——非变性沉淀

pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等

;不可逆沉淀

强烈沉淀条件

破坏Pr胶体溶液稳定性

也破坏Pr结构和性质

沉淀不能再重新溶解

——变性沉淀

如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐

和生物碱沉淀等;1.盐析法

加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性;等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶

原因？;盐析;2.有机溶剂沉淀

脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用

3.等电点沉淀;4.重金属盐沉淀

与带负电荷蛋白质结成不溶性盐

5.生物碱试剂和某些酸类沉淀

与带正电荷蛋白质生成不溶性盐

6.加热变性沉淀

天然结构解体，疏水基外露，

破坏水化层及带电状态;一.?分离纯化蛋白质的意义

1.研究蛋白质的结构与功能：

要求纯度高，不变性；

2.提取活性的酶或蛋白质：

必须保持天然活性状态；

3.作为药物或食品添加剂：

纯度要求一般。

二、蛋白质提纯的总目标：

增加制品纯度或比活力，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质的产量达到最高值。;三、蛋白质分离纯化的一般原则;2、根据溶解度分;五、蛋白质的分离纯化方法;现在是15页\一共有47页\编辑于星期五;;凝胶过滤;凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外

洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大.测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex;（二）利用溶解度差别的纯化方法;2.?盐析

在蛋白质的水溶液中??加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。

而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。

盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。

盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。;3.有机溶剂分级分离法;电泳原理

蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0

分子大小不同，电场中移动速度也不同;电泳迁移率(泳动度);水平式平板凝胶电泳;等电聚焦电泳;双向电泳;离子交换层析;（七）利用蛋白质选择性吸附的性质;利用选择性吸附的纯化方法;（八）利用对配体的特异生物学

亲和力的纯化方法;现在是31页\一共有47页\编辑于星期五;六、蛋白质含量测定和纯度鉴定;蛋白质的分子量

一般在一万至一百万道尔顿之间

1道尔顿＝1×C12绝对质量/12

≈1.66×10-27千克

;（一）根据化学组成测定最小分子量;（二）凝胶过滤法测定相对分子质量;;（三）SDS－PAGE测定相对分子质量;现在是38页\一共有47页\编辑于星期五;;现在是40页\一共有47页\编辑于星期五;现在是41页\一共有47页\编辑于星期五;现在是42页\一共有47页\编辑于星期五;沉降速度法测定相对分子量;蛋白质的含量测定与纯度测定;蛋白质含量测定Ⅱ;蛋白质含量测定Ⅲ;谢谢大家！