实时荧光定量技术讲课文档.pptVIP

实时荧光定量技术;优选实时荧光定量技术;常规PCR与实时荧光定量PCR;荧光定量PCR常用的三个概念;Cycle（循环数）;Cycle（循环数）;Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数;Ct值的数学原理;Cyclenumber;qPCR常用实验方法;;热变性;问题点：

SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如

果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将

同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。

;将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT);融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光

定量准确;使用方便，不必设计复杂

探针

具有价格优势;Taqman探针法——原理;Taqman探针法——工作机理;1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，

引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃

2、反应参数的确定：

一般为：94℃，10-20S

60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度

3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值

引物浓度：100-900nM

探针浓度：50-300nM

4、其他与常规PCR相同;高度特异性

重复性好

灵敏度高

可进行多重定量;标记荧光的发夹探针

环与目标序列互补

茎由互补配对序列组成;;高特异性：对目标序列

检测SNP最灵敏的试剂之一

荧光背景低;几种方法的应用比较;绝对定量

标准曲线由已知浓度的RNA、质粒生成

定量未知模板

标准样品和未知样品必须同时反应

相对定量

??CtMethod:使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因，

参照基因可以与目的基因同时反应，也可以单独反应。

双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。

;;一个目的基因——即需要确定其量值的核酸序列。

一组标准样本——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。

重复反应孔???——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。

标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可。

实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。;;

方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测

试剂：RealMasterMix（Probe）

标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照

实验步骤：提取HBVDNA；

设计特异引物；

设计TaqMan探针并标记探针；

荧光定量扩增；

结果分析：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数。;Sample;扩增效率（E）计算

E=10-1/slope－1

=10-1/-3.29－1

=2.01－1

=1.01;未知样品拷贝数的计算;;一个参照样本

一个或一个以上的未知样本

一个目的基因

管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量

重复反应孔–——建议每个样本设置三个或三个以上重复孔，以确保统计结果的可信度。

标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可。

实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。

一组标准样本（有些分析方法不需要）;管家基因

维持细胞基本代谢活动所必须的基因,

如：GAPDH、Actin、18SrRNA等;双标准曲线法

2-△△Ct法

;相对定量分析实例分析;双标准曲线法;样品扩增：正常vs肿瘤;双标准曲线法——实验结果;Healthy

RNA;ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.