高效毛细管电泳.pptVIP

5.添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向某些阳离子表面活性剂使电渗流减小，某些阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，电渗流增大（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使溶液的粘度减小，电渗流增大。*第29页，共67页，星期日，2025年，2月5日*第30页，共67页，星期日，2025年，2月5日四、柱效和分离度（一）理论塔板数和塔板高度用理论塔板数n和塔板高度H表示柱效。n可以直接由电泳图求出tm为起点到谱峰最高点所对应的时间，称为迁移时间。因为毛细管中，没有固定相，不存在组分在固定相中分配和保留。*第31页，共67页，星期日，2025年，2月5日塔板高度H为：Lef为进样口到检测器的距离,为有效柱长.检测器在柱上，LefL（二）谱带展宽在理想的情况下，纵向扩散是HPCE中导致谱带展宽的唯一因素。根据范第母特方程1.纵向扩散D是溶质组分的扩散系数*第32页，共67页，星期日，2025年，2月5日V是电压，L是毛细管全长。纵向扩散与扩散系数成正比，与表观电泳速度成反比。Vap小，tm长，谱峰展宽。若只考虑纵向扩散，则理论塔板数为由上式可知，n与电场强度E（或电压V）成正比，与溶质的扩散系数成反比。大分子比小分子扩散系数小，可以获得更高的分离效率。*第33页，共67页，星期日，2025年，2月5日在HPCE中，溶质在几万至十几万伏的电压下，迁移速度较快，纵向扩散小，柱效高。在实际电泳过程中，出了溶质的纵向扩散外，还存在很多引起谱峰展宽的因素，如焦耳热、吸附等。2.焦耳热电流通过毛细管内缓冲溶液时产生自热，称焦耳热。焦耳热通过管壁向周围环境散热，管中心温度最高，由中心向管壁温度逐渐下降。温度高粘度小，因而管中心的迁移速度最快，管壁附近的迁移速度最慢，破坏了溶质带的扁平流轮廓，导致溶质区带展宽。*第34页，共67页，星期日，2025年，2月5日小内径毛细管散热面积大，温度梯度小，谱峰展宽小。但是，内径过细会带来检测、进样等方面的一系列困难，又易造成柱的堵塞。因此目前采用的多是内径25～75μm柱子。采用低淌度缓冲液，如Tris[三-（羟基甲基）氨基甲烷]等。这种粒子的质荷比很大，可以减小工作电流。采用温度控制装置，尽快除去热量，使系统尽可能地保持恒温，是目前常采用的办法。冷却温控的方法有两种，气冷和液冷，一般条件下，用气冷已可以满足要求。*第35页，共67页，星期日，2025年，2月5日3.吸附毛细管内壁对靠近内壁的溶质粒子的吸附，使迁移速度减慢，导致谱峰变宽。造成管内壁表面吸附的主要原因有两个:①在电解质溶液PH大于3时，石英毛细管壁带负电荷，因静电引力溶质阳离子被管壁吸附。②蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，有较强的疏水作用，被极性水溶剂向管壁挤压，在PH小于3，管壁呈电中性时尤为明显。抑制或消除吸附的常用方法有：*第36页，共67页，星期日，2025年，2月5日（1）采用极端pH条件。即在低pH（2～3）或高pH（＞9）的缓冲液中进行CE分离，这样可以抑制管壁硅醇基的离解或使被分析物质带负电，与管壁相斥，吸附受到抑制。（2）对管壁内表面加以修饰（三）分离度毛细管中的分离度也用R表示，可按谱图直接由下式计算：*第37页，共67页，星期日，2025年，2月5日分离度也可表示为柱效的函数：*第38页，共67页，星期日，2025年，2月5日影响分离度的主要因素①工作电压V；②毛细管有效长度与总长度比；③相邻两组分的有效电泳淌度差；④表观淌度。*第39页，共67页，星期日，2025年，2月5日第三节毛细管电泳仪毛细管电泳仪结构比高效液相色谱仪简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器等。前三个部件均易实现,困难之处在于检测器。*第40页，共67页，星期日，2025年，2月5日*第41页，共67页，星期日，2025年，2月5日一、高压电源（1）0～30kV稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；二、电极槽CE的电极通常由直径0.5~1mm的铂丝制成，电极槽通常是带螺口的小玻璃瓶或塑料瓶（1~5mL不等），要便于密封。*第42页，共67页，星期日，2025年，2月5日三、进样系统一般的进样方式是电动进样和压力进样。