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基因工程概述

1。什么是基因工程，基因工程的基本流程？

基因工程(Gｅnetiｃengｉneeｒing）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一个或多个生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一个生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并体现出新的性状。所以,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素．

1。分离目标基因

2。限制酶切目标基因与载体

3。目标基因和载体DNＡ在体外连接

4。将重组DNA分子转入适宜的宿主细胞，进行扩增培养

５.选择、筛选含目标基因的克隆

6。培养、观测目标基因的体现

基因工程的载体和工具酶

1。基因工程载体必须满足哪些基本条件?

具备对受体细胞的可转移性或亲和性。

具备与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点．

具备多个单一的核酸内切酶识别切割位点。

具备适宜的筛选标记。

分子量小,拷贝数多.

具备安全性.

2。质粒载体有什么特征,有哪些重要类型?

1、自主复制性

２、可扩增性

3、可转移性

４、不相容性

重要类型有1。克隆质粒２。测序质粒3。整合质粒4．穿梭质粒5。探针质粒６。体现质粒

3.质粒的构建

（1)删除无须要的DNＡ区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源DＮA片段的装载量。通常来说,不小于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。

(2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的ｍob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境,保证DＮＡ重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数

(3)加入易于识别的选择标记基因，最正确是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞．

（4）在选择性标记基因内引入具备多个限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylｉnker),便于多个外源基因的重组,同时删除反复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶解决后,只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。

（5)依照外源基因克隆的不一样规定,分别加装特殊的基因体现调控元件．

4.什么是人工染色体载体？

将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分派区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体

5。什么是穿梭载体？

人工构建的、具备两种不一样复制起点和选择标记、可以在两种不一样的寄主细胞中存活和复制的载体。

6．入-噬菌体载体及构建

l—DNＡ为线状双链ＤNA分子,长度为4８。５kb,在分子两端各有1２个碱基的单链互补粘性末端.

1缩短长度提高外源ＤNA片段的有效装载量删除反复的酶切位点

引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNＡ片段克隆的可操作性

灭活某些与裂解周期关于基因。

使λ-ＤNＡ载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以防止可能出现的污染现象的发生。

加装选择标记,便于重组体的检测

7。M13单链噬菌体DNA载体

过定点诱变技术封闭反复的重要限制性酶切口。

引入适宜的选择性标记基因,如含有开启子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列（lacZ)的乳糖操纵子片段(lac）、组氨酸操纵子片段（ｈiｓ）以及抗生素抗性基因等．

将人工合成的多克隆位点接头片段插在lacZ’标记基因内部，使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体DNA的混浊噬菌斑呈蓝色。

（4）在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DＮA测序引物序列,使得重组DNA分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反映。

8.II类限制性内切核酸酶的特点

限制性核酸内切酶（Resｔrictionenｄonucｌeasｅs）是一类能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段的核酸水解酶.

识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或６核苷酸构成的特定序列(靶序列)。

识别序列的对称性:靶序列通常具备双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。

切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称(可形成粘性末端或平末端的DNＡ分子）．

同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不一样，这些酶称为同位酶。

同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不一样起源的酶称为同裂酶

同尾酶(Iｓocandamerｓ）:识别位点不一样,但切出的DＮＡ片段具备相同的末端序列,这些酶称为同尾酶。

9。甲基化酶

Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶搭档,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口。甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时，却产生出另一个酶的切口

甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使ＤNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割。

甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。