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transwell实验操作步骤及原理解析

Transwell实验操作步骤及原理解析

Transwell实验，作为一种经典的体外细胞迁移与侵袭研究手段，其核心原理在于利用特殊设计的小室装置，为细胞的跨膜运动提供一个可控的体外模型。这项技术广泛应用于肿瘤学、细胞生物学、免疫学等多个研究领域，帮助科研人员深入理解细胞的运动机制、探索潜在的治疗靶点以及评估药物对细胞迁移/侵袭能力的影响。本文将详细解析Transwell实验的基本原理、具体操作步骤以及实验过程中的关键注意事项，旨在为相关研究提供一份专业且实用的参考指南。

一、Transwell实验基本原理

Transwell实验的核心在于其特殊的Transwell小室（Transwellchamber），通常是一个可放置于普通培养板孔内的杯状结构。该小室的底部是一层具有特定孔径的聚碳酸酯（polycarbonate,PC）滤膜或聚酯（polyester,PET）膜。实验时，将待研究的细胞接种于小室的上室，而在下室中加入含有趋化因子（或特定实验处理因素）的培养液。

细胞迁移实验（CellMigrationAssay）：细胞具有向特定化学信号（趋化因子）或因密度梯度等因素发生定向移动的能力。在上室中，细胞感知到下室趋化因子的存在后，会主动向滤膜底部迁移，并尝试穿过膜上的小孔。经过一定的培养时间后，未穿过膜的上室细胞被擦去，而成功穿过膜并附着于膜下表面的细胞则被固定、染色，最后通过显微镜观察和计数这些穿膜细胞，即可反映细胞的迁移能力。

细胞侵袭实验（CellInvasionAssay）：与迁移实验的主要区别在于，Transwell小室的聚碳酸酯膜上会预先均匀包被一层人工基底膜基质（如Matrigel）。这层基质模拟了体内细胞外基质（ECM）的环境。因此，细胞要从上室迁移到下室，不仅需要具备迁移能力，还必须能够分泌或诱导产生蛋白酶，降解这层人工基底膜，从而实现“侵袭”过程。因此，侵袭实验更能模拟体内肿瘤细胞侵袭周围组织的生物学行为。

简言之，两种实验均利用了细胞的趋化运动特性，通过计数穿膜细胞的数量来量化细胞的迁移或侵袭能力。膜的孔径大小选择取决于细胞类型，确保目标细胞能够穿过，而过大的孔径可能导致非特异性穿膜。

二、Transwell实验操作步骤

（一）实验材料准备

1.Transwell小室：根据实验目的（迁移/侵袭）和细胞类型选择合适孔径（如常用的8μm，也有3μm、5μm等）和膜材质的小室。侵袭实验需选择未包被或可自行包被基质胶的小室。

2.培养板：24孔板是最常用的配套培养板，每个孔可放置一个Transwell小室。

3.细胞系：处于对数生长期、状态良好的目的细胞。

4.细胞培养液：

*无血清培养基或含低浓度血清（如0.1%-1%）的培养基：用于饥饿处理细胞和上室细胞悬液制备。

*含高浓度血清（如10%-20%）或特定趋化因子的完全培养基：作为下室的趋化因子来源。

5.人工基底膜基质（Matrigel）：用于侵袭实验，使用前需按说明书要求在冰上解冻。

6.消化液：如胰蛋白酶-EDTA溶液。

7.PBS缓冲液。

8.固定液：如4%多聚甲醛（PFA）。

9.染色液：如0.1%-0.5%结晶紫溶液、苏木素伊红（HE）染色液或Giemsa染色液等。

10.棉签或专用细胞刮：用于擦去上室未迁移的细胞。

11.其他：超净工作台、CO?培养箱、倒置显微镜、计数板、离心机、移液器及配套吸头等。

（二）细胞准备

1.细胞消化与计数：取对数生长期的细胞，用PBS轻洗1-2次，加入适量胰蛋白酶-EDTA消化。待细胞变圆、间隙增大后，加入含血清的完全培养基终止消化，轻柔吹打制成单细胞悬液。离心（Xrpm，X分钟）后弃上清，用无血清培养基重悬细胞，计数，并调整细胞浓度至实验所需密度（此密度需预实验摸索，以最终穿膜细胞数适中、不重叠为宜）。

2.细胞饥饿处理（可选）：为消除血清中生长因子对细胞迁移的潜在影响，提高实验的特异性，可将调整好密度的细胞悬液在37℃、5%CO?培养箱中饥饿培养X小时（通常12-24小时，具体时间依细胞类型而定），使细胞周期同步化并处于静息状态，更易响应下室的趋化信号。

（三）Transwell小室准备（以侵袭实验为例，迁移实验可省略此步或直接使用预包被小室）

1.Matrigel基质胶的稀释与铺板：

*在冰上操作，将Matrigel用预冷的无血清培养基按一定比例稀释（稀释比例需根据细胞侵袭能力和实验经验摸索，通常1:5至1:10不等，目标是形成一层连续且不过厚的胶层）。

*轻柔混匀稀释后的Matrigel，避免产生气泡。

*向Transwell小室的上室（膜的上表面）加入适量稀释好的Ma