发芽大豆γ-氨基丁酸富集与调控技术研究.docxVIP

发芽大豆γ-氨基丁酸富集与调控技术研究

摘要

本文聚焦于发芽大豆γ-氨基丁酸（GABA）的富集与调控技术。通过研究低氧胁迫、盐（NaCl）胁迫及其联合处理对发芽大豆不同生长阶段、芽体各部位中GABA含量变化的影响，筛选出GABA富集量最高时的氧分压与盐浓度。在此基础上，探究GABA支路中关键酶-谷氨酸脱羧酶（GAD）活性以及多胺降解途径中关键酶-二胺氧化酶（DAO）活性的抑制试剂对GABA富集量的影响，确定两途径的贡献率。同时，研究低氧胁迫下盐处理时，脱落酸（ABA）抑制剂、Ca2+抑制剂对发芽大豆中GAD和DAO活性、谷氨酸和腐胺降解量及GABA富集量的影响，从分子水平揭示发芽大豆GABA富集与调控机理，为提高逆境胁迫条件下发芽大豆合成GAD和DAO能力和活性，增强GABA富集效果提供理论依据。

关键词

发芽大豆；γ-氨基丁酸；富集；调控；逆境胁迫

一、引言

γ-氨基丁酸（GABA）作为一种广泛存在于生物体内的非蛋白质氨基酸，具有诸多重要生理功能。在哺乳动物中，它是脑和脊髓中抑制性神经传导物质，可改善脑部机能、镇静神经、改善睡眠等。在植物领域，GABA与植物在逆境环境下的应对机制密切相关。随着全球气候的变化，干旱、高盐和低氧等环境胁迫对植物的影响愈发显著，植物体内的代谢和生理途径会进行调整以适应环境变化，其中GABA富集就是植物的一种重要代谢调整策略。

大豆作为一种重要的农作物，其发芽过程中GABA的富集研究具有重要意义。通过对发芽大豆GABA富集与调控技术的深入探究，不仅有助于揭示植物在逆境胁迫下的生理响应机制，还能为开发富含GABA的功能性大豆制品提供技术支持，满足消费者对健康食品的需求。目前，关于盐和低氧胁迫下发芽大豆GABA富集与调控机理的研究在国内外受到广泛关注，但仍存在诸多待解决的问题，本研究旨在填补相关空白，具有重要的理论意义和应用价值。

二、材料与方法

2.1实验材料

选用东北大豆作为实验原料，确保其品质优良、颗粒饱满、无病虫害。实验所用试剂包括谷氨酸钠、磷酸吡哆醛、CaCl2、NaCl、EGTA（乙二醇二乙醚二胺四乙酸）、AG（氨基胍）、ABA（脱落酸）、Flu（氟草酮）等，均为分析纯，购自正规化学试剂公司。

2.2实验仪器

主要仪器有恒温培养箱、光照培养箱、高速冷冻离心机、酶标仪、PCR仪、高效液相色谱仪等，用于控制实验条件、进行样品处理和分析检测。

2.3实验方法

2.3.1大豆发芽实验

将大豆种子用清水洗净，浸泡于不同处理的培养液中，在设定的温度、湿度和通气条件下进行发芽培养。实验设置多个处理组，包括正常发芽对照组、低氧胁迫组、盐胁迫组以及低氧联合盐胁迫组等。低氧胁迫通过控制培养环境中的氧分压实现，盐胁迫通过在培养液中添加不同浓度的NaCl来施加。在发芽过程中，定期取样，测定芽长、鲜重、干重等生长指标，并分析不同部位（子叶、胚、胚根等）中GABA含量及相关酶活性。

2.3.2GABA含量测定

采用高效液相色谱法测定发芽大豆中GABA含量。将样品粉碎后，用适量的提取液提取GABA，提取液经离心、过滤等预处理后，注入高效液相色谱仪进行分离检测。通过与GABA标准品的保留时间和峰面积进行对比，计算样品中GABA的含量。

2.3.3酶活性测定

谷氨酸脱羧酶（GAD）活性测定采用分光光度法，利用GAD催化谷氨酸脱羧生成GABA和CO2的反应，通过检测反应体系中CO2的生成量来间接测定GAD活性。二胺氧化酶（DAO）活性测定则基于DAO催化腐胺氧化生成H2O2和4-氨基丁醛的反应，通过检测H2O2的生成量来确定DAO活性。

2.3.4基因表达水平分析

采用实时荧光定量PCR技术分析发芽大豆中GAD和DAO等相关基因的表达水平。提取样品中的总RNA，反转录为cDNA后，以cDNA为模板进行PCR扩增。通过与内参基因的比较，计算目的基因的相对表达量。

2.3.5数据分析

实验数据采用SPSS统计软件进行分析，结果以平均值±标准差表示。通过单因素方差分析、相关性分析等方法，探讨不同处理对发芽大豆生长、GABA富集及相关酶活性、基因表达水平的影响，确定各因素之间的相互关系。

三、结果与分析

3.1大豆发芽富集GABA的适宜条件

3.1.1低氧胁迫下的最优条件

在低氧胁迫条件下，通过响应面实验优化得到大豆发芽富集GABA的最优发芽条件为：培养温度30.5℃、培养液pH4.13、通气量0.91L/min。在此条件下，GABA富集量达到2.65mg/gDW，为原料的16.6倍。这表明低氧