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猪胰腺弹性蛋白酶原于毕赤酵母的表达与纯化研究

一、引言

1.1研究背景与意义

猪胰腺弹性蛋白酶原是一种在生物技术和医药领域具有重要应用价值的蛋白质。弹性蛋白酶能够特异性地降解弹性蛋白，在生物体内参与组织重塑、免疫调节等多种生理过程。从猪胰腺中提取的弹性蛋白酶原，经过激活后可转化为具有活性的弹性蛋白酶，其在医药方面的应用十分广泛，如改善脂质代谢、保护肝脏、抑制动脉硬化、降血压、耐缺氧保护心肌等。在食品工业中，弹性蛋白酶可用于肉类嫩化、蛋白质水解等，提高食品的品质和口感；在日用化工领域，其有助于开发新型的护肤和清洁产品；此外，它还可作为生物防治的辅助剂以及应用于环境保护领域。然而，从猪胰腺中直接提取弹性蛋白酶原存在诸多限制，如提取过程复杂、产量低、成本高，且易受到原材料供应和质量的影响，难以满足大规模工业化生产的需求。

毕赤酵母表达系统作为一种高效的真核表达系统，在过去几十年中得到了广泛的研究和应用。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母菌，它能够利用甲醇作为唯一碳源和能源。该表达系统具有独特的优势，首先，它含有强有力的醇氧化酶基因（AOX1）启动子，可被甲醇严格调控，使外源基因在需要时高效表达，避免了不必要的能量消耗和代谢负担；其次，毕赤酵母能够进行蛋白质的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等，这对于保持蛋白质的天然结构和功能至关重要，许多蛋白质在原核表达系统中无法正确折叠和修饰，而毕赤酵母表达系统能够克服这一问题；再者，毕赤酵母的培养基成本低廉，生长迅速，易于进行大规模发酵培养，能够实现高密度发酵，从而提高蛋白质的产量，降低生产成本；此外，外源蛋白基因能够稳定地整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失，保证了表达菌株的稳定性和遗传特性。将猪胰腺弹性蛋白酶原基因导入毕赤酵母中进行表达，有望解决传统提取方法的不足，实现弹性蛋白酶原的大量生产，为其在各个领域的广泛应用提供充足的原料。

本研究旨在通过基因工程技术，将猪胰腺弹性蛋白酶原基因克隆到毕赤酵母表达载体上，并转化毕赤酵母细胞进行表达，然后对表达产物进行纯化和鉴定。这不仅有助于深入了解猪胰腺弹性蛋白酶原的生物学特性和功能，还能够为其在医药、食品、化工等领域的应用提供技术支持和理论依据，对于推动相关产业的发展具有重要的现实意义。同时，该研究也为其他蛋白质的高效表达和生产提供了参考和借鉴，具有一定的科学价值。

1.2国内外研究现状

在国外，对于猪胰腺弹性蛋白酶原在毕赤酵母中表达及纯化的研究开展较早。一些研究团队成功构建了含有猪胰腺弹性蛋白酶原基因的毕赤酵母表达载体，并实现了该基因在毕赤酵母中的表达。他们通过优化表达条件，如甲醇诱导浓度、诱导时间、培养温度等，提高了弹性蛋白酶原的表达量。在纯化方面，采用了多种色谱技术，如离子交换色谱、凝胶过滤色谱等，对表达的弹性蛋白酶原进行分离和纯化，获得了较高纯度的目标蛋白，并对其酶学性质进行了详细研究。此外，还有研究关注弹性蛋白酶原在毕赤酵母表达过程中的翻译后修饰情况，以及修饰对其活性和稳定性的影响。

国内的相关研究也取得了一定进展。科研人员同样致力于构建高效表达猪胰腺弹性蛋白酶原的毕赤酵母工程菌株，通过对基因序列的优化、表达载体的改造以及发酵条件的优化，提高了弹性蛋白酶原的产量和质量。在纯化工艺上，结合国内实际情况，探索出了一些经济有效的纯化方法，降低了生产成本。同时，国内研究还注重弹性蛋白酶原在医药、食品等领域的应用研究，评估其在相关应用中的效果和安全性。

然而，现有研究仍存在一些不足和待解决的问题。一方面，尽管通过各种优化手段提高了弹性蛋白酶原的表达量，但与实际生产需求相比，仍有提升空间，需要进一步深入研究表达机制，挖掘更多影响表达的因素并加以优化；另一方面，在纯化过程中，如何提高纯化效率、降低纯化成本，同时保证蛋白的活性和纯度，仍是需要攻克的难题。此外，对于弹性蛋白酶原在毕赤酵母中表达的稳定性和一致性研究还不够充分，不同批次表达产物的质量可能存在波动，这给大规模工业化生产带来了挑战。

1.3研究内容与方法

本研究的主要内容包括以下几个方面：首先，从猪胰腺组织中提取总RNA，通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术扩增猪胰腺弹性蛋白酶原基因（proELA2），并将其克隆到TA载体上进行测序验证；接着，构建毕赤酵母表达载体P.pastoris/pPICZαA-proELA2，将重组表达载体线性化后转化毕赤酵母细胞，筛选阳性转化子；然后，对重组猪proELA2酶原在毕赤酵母中的表达条件进行优化，包括诱导时间、抗性水平、甲醇添加方式、生长菌密度以及诱导培养液起始pH值等因素对目的蛋白表达水平的影响；之后，对表达的重组蛋白进行纯化，采用合适的色谱方法分离纯化弹性蛋白酶原，并通过Westernblot验证其正确性；最后，对