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铜绿假单胞菌标准操作手册

引言

铜绿假单胞菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然环境中，亦是临床重要的条件致病菌。其因具有复杂的耐药机制和顽强的生存能力，在医院感染控制及临床微生物检验中占据重要地位。本手册旨在为从事铜绿假单胞菌分离、鉴定、药敏试验及相关研究的实验室人员提供一套标准化、规范化的操作指引，以确保实验结果的准确性、可靠性和重复性，并保障实验室生物安全。本手册适用于临床微生物实验室、科研机构及相关质量控制部门。

1.生物安全要求

铜绿假单胞菌可引起免疫功能低下者的严重感染，因此所有操作必须在符合相应生物安全级别的实验室中进行，并严格遵守以下规定：

1.1个人防护装备(PPE)

*实验服：应穿着长袖、防水、后部闭合的实验服或隔离衣，袖口应收紧。

*手套：操作所有样本、培养物及可能被污染的表面时必须佩戴一次性乳胶或丁腈手套。手套应在操作不同样本或离开操作区域前更换。

*护目镜/面罩：进行可能产生气溶胶或液体飞溅的操作（如混匀、离心、接种）时，必须佩戴护目镜或面罩。

*帽子和口罩：根据操作风险评估，必要时佩戴。在处理高度可疑或大量培养物时，建议佩戴。

*鞋套：在特定高风险操作区域或生物安全柜外进行大规模操作时可考虑使用。

1.2实验室操作规范

*禁止在实验室内饮食、饮水、吸烟、化妆或处理隐形眼镜。

*禁止用戴手套的手触摸口鼻、眼睛或面部。

*操作台面应保持整洁，实验结束后立即用适宜的消毒剂（如含氯消毒剂）擦拭消毒。

*所有操作应尽可能在生物安全柜内进行，特别是涉及分离培养、挑取菌落、制备菌悬液等步骤。

*锐器（如针头、刀片）应放入专用的防刺穿锐器盒中，禁止徒手折弯或折断针头。

1.3废弃物处理

*所有污染的培养物、耗材（如吸管、试管、培养皿）应置于适当的生物危害垃圾袋或高压灭菌袋中，经高压灭菌处理后再按医疗废弃物处理。

*液体废弃物应加入适当的化学消毒剂处理或经高压灭菌后倾倒。

1.4应急处理

*皮肤污染：立即用大量流动清水冲洗污染部位，必要时使用肥皂水。

*黏膜污染：立即用大量流动清水或生理盐水冲洗污染的眼、鼻、口等黏膜部位至少15分钟。

*锐器刺伤：立即从伤口近心端向远心端轻轻挤压，尽可能挤出损伤处的血液，再用大量流动清水冲洗，然后用碘伏等消毒剂消毒伤口，并及时报告实验室负责人及医疗机构相关部门进行医学评估和随访。

*泄漏处理：发生培养物泄漏时，应立即停止操作，在现场放置警示标识，穿戴好适当的PPE后，用浸有消毒剂的吸水材料覆盖泄漏物，作用适当时间后（如30分钟），小心清理，所有清理物按污染物处理，并对污染区域进行彻底消毒。

2.样本接收与处理

2.1样本接收与核对

*接收样本时，应核对样本标识（如患者信息、样本类型、采集日期和时间）与检验申请单是否一致。

*检查样本容器是否完好，有无泄漏，样本量是否符合检验要求，运输条件是否恰当。

*对不合格样本（如容器破损、标签不清、样本量不足、严重溶血/污染），应按照实验室规定处理，并记录拒收原因及与申请方的沟通情况。

2.2样本登记与预处理

*及时准确登记样本信息，包括唯一编号、患者信息、样本类型、检验项目、接收时间等。

*根据样本类型和检验目的进行适当的预处理。例如，痰液样本需进行革兰染色评估标本质量，合格痰液进行接种；脑脊液、胸腹水等无菌体液需离心后取沉淀物接种或直接划线接种。

2.3样本储存与运输

*不能立即处理的样本应按照特定要求储存。一般而言，临床样本在2-8℃可短期保存数小时至一天，但某些对温度敏感的样本可能需要特殊处理。

*运输样本应符合生物安全运输规定，使用防泄漏、有生物危害标识的专用运输箱。

3.分离培养

3.1培养基选择

*非选择性培养基：血琼脂平板（BAP），用于观察菌落形态、溶血特性及进行初步生化试验。

*选择性培养基：

*麦康凯琼脂平板（MAC）：抑制革兰阳性菌生长，铜绿假单胞菌可生长，菌落无色或淡粉色。

*cetrimide琼脂平板（CA，又称NAC琼脂）：对铜绿假单胞菌有较强的选择性，可抑制部分其他革兰阴性杆菌生长，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，并常可产生特征性色素。

*假单胞菌琼脂基础+色素产生试剂（如PseudomonasIsolationAgar,PIA）：有助于绿脓素和荧光素的产生和观察。

*根据样本类型和临床需求选择合适的培养基组合。通常推荐BAP与一种选择性培养基（如CA或MAC）联合使用。

3.2接种与孵育

*用无菌接种环或接种针取适量样本，在所选培养基上进行划线分离，以获得单个菌落。

*对于液体样本（如尿液