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细胞免疫学实验操作规程

一、实验概述

细胞免疫学实验是研究免疫细胞（如T细胞、B细胞、NK细胞等）功能、分化和相互作用的重要手段。本规程旨在规范细胞免疫学实验的操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性。实验内容主要包括细胞分离、培养、刺激、检测等环节。

二、实验准备

（一）试剂与耗材

1.主要试剂

-RPMI1640培养基

-FBS（胎牛血清）

-PBS缓冲液

-胰蛋白酶（0.25%浓度）

-胎牛血清（10%）

-细胞刺激剂（如PMA、离子霉素等）

-细胞因子检测试剂盒（如ELISA试剂盒）

2.耗材

-细胞培养皿/板

-离心管（50mL、15mL）

-移液器（1000μL、200μL、10μL）

-滤膜（0.22μm）

-流式细胞术管

-ELISA板

（二）仪器设备

1.细胞培养箱（37°C，5%CO?）

2.离心机（可调节转速，如1000-5000r/min）

3.流式细胞仪

4.酶标仪

5.超净工作台

（三）细胞来源

1.外周血单个核细胞（PBMC）分离：

-采集新鲜外周血（抗凝管，如EDTA管）

-使用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离PBMC

三、实验操作流程

（一）细胞分离与培养

1.PBMC分离（Ficoll-Paque法）

-步骤：

(1)外周血与Ficoll-Paque溶液按1:1比例混合

(2)离心（2000r/min，30分钟）

(3)收集界面细胞，洗涤（PBS洗2次）

(4)重悬细胞，计数备用

2.细胞培养

-步骤：

(1)将PBMC重悬于RPMI1640培养基（含10%FBS）

(2)接种于培养皿/板（如1×10?细胞/mL）

(3)37°C，5%CO?培养48-72小时

（二）细胞刺激

1.PMA/Ionomycin刺激（用于T细胞增殖实验）

-步骤：

(1)向培养细胞中加入PMA（终浓度50ng/mL）和离子霉素（终浓度500ng/mL）

(2)37°C，5%CO?培养4-6小时

2.抗原刺激（如CD3单抗刺激）

-步骤：

(1)加入CD3单抗（终浓度5μg/mL）

(2)37°C，5%CO?培养72小时

（三）细胞检测

1.流式细胞术检测

-步骤：

(1)细胞固定（4%多聚甲醛，30分钟）

(2)PBS洗涤（2次）

(3)加入荧光标记抗体（如CD4、CD8、IFN-γ等）

(4)4°C避光孵育30分钟

(5)流式细胞仪检测（设阴性对照）

2.ELISA检测细胞因子

-步骤：

(1)收集细胞上清液，-20°C冻存备用

(2)ELISA板加标准品/样品

(3)加入生物素化抗体和酶标抗体

(4)底物显色（TMB），酶标仪读板（450nm）

四、实验注意事项

1.无菌操作：所有步骤需在超净工作台进行。

2.细胞计数：每次接种前需确认细胞浓度（如使用计数板或细胞计数仪）。

3.试剂保存：FBS需4°C保存，冻存型需thaw后4°C使用。

4.对照设置：每组实验需设置阴性对照（未刺激组）和空白对照（无细胞组）。

5.数据记录：及时记录实验参数（如细胞浓度、试剂批号等）。

五、实验结果分析

1.流式细胞术：根据抗体荧光强度分析细胞亚群比例（如CD4?/CD8?T细胞比例）。

2.ELISA：通过标准曲线计算细胞因子浓度（如IFN-γ：10-1000pg/mL）。

3.统计分析：使用GraphPadPrism等软件进行数据对比（如t检验、ANOVA）。

六、实验总结

细胞免疫学实验操作需严格遵循标准化流程，确保细胞状态和试剂质量。实验结果的分析需结合具体研究目的，合理解读数据。

三、实验操作流程（续）

（一）细胞分离与培养（续）

1.PBMC分离（Ficoll-Paque法）

-步骤：

(1)外周血与Ficoll-Paque溶液混合：

-取等体积（如10mL）外周血与Ficoll-Paque预冷溶液（已置于4°C冰箱平衡30分钟）混合，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡。

(2)密度梯度离心：

-将混合液缓慢加至15mL离心管底部，无需铺层。

-离心条件：2000r/min，30分钟，室温，水平离心机。

-离心后可见三层：上层血浆、中部淡黄色PBMC带、下层红细胞沉淀。

(3)PBMC收集与洗涤：

-用移液器小心吸取中部PBMC带，避免吸到上层血浆或下层红细胞。

-加入10mL预冷PBS，轻轻吹打重悬细胞。

-1000r/min离心5分钟，弃上清。重复洗涤2次。

(4)细胞重悬与计数：

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