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紫外分光光度计原理及操作指南

在现代实验室的众多分析仪器中，紫外分光光度计占据着不可或缺的地位。它凭借其操作简便、灵敏度高、分析速度快等特点，广泛应用于化学、生物、医药、环境等多个领域，成为定性鉴别物质、定量分析组分含量的有力工具。理解其工作原理并掌握规范的操作方法，是确保分析结果准确性与可靠性的基础。

一、紫外分光光度计的基本原理

紫外分光光度计的核心工作原理建立在物质对光的选择性吸收特性之上，具体而言，是基于分子的紫外-可见吸收光谱。

1.1分子吸收光谱的产生

当一束特定波长的紫外光（通常指波长在190nm至400nm范围内）照射到物质分子时，分子中的价电子会吸收光子的能量，从基态跃迁到激发态。不同的分子，因其组成和结构的差异，所能吸收的光子能量也各不相同，这就表现为它们对不同波长的紫外光具有不同的吸收程度。这种特定的吸收pattern便构成了该物质的紫外吸收光谱，如同物质的“指纹”，可用于初步的定性分析。

1.2朗伯-比尔定律（Lambert-BeerLaw）

定量分析的理论基础则是朗伯-比尔定律。该定律描述了物质对光的吸收程度与该物质的浓度以及光通过的物质厚度之间的关系。其数学表达式为：

A=εbc

其中：

*A为吸光度（Absorbance），无量纲，表示物质对光的吸收程度。

*ε为摩尔吸光系数（Molarabsorptivity），单位为L/(mol·cm)，它与物质的性质、入射光波长及温度等因素有关，是物质在特定波长下的特征常数。

*b为光在样品中通过的路径长度，通常以厘米（cm）为单位，即比色皿的厚度。

*c为样品溶液的摩尔浓度（mol/L）。

在实际操作中，当比色皿厚度和入射光波长固定时，吸光度A与溶液浓度c成正比。通过测量已知浓度标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，再测量未知样品的吸光度，即可根据标准曲线求出未知样品的浓度。

二、紫外分光光度计的主要结构

尽管不同型号的紫外分光光度计在外观和功能上可能存在差异，但其基本构成单元是相似的，主要包括以下几个部分：

1.光源：提供稳定且具有一定强度的紫外光。常见的紫外光源有氘灯，它能发射190nm至400nm波长范围的连续光谱。部分仪器也会配备可见光源（如钨灯），组成紫外-可见分光光度计。

2.单色器：将光源发出的复合光分解为单色光，并能从中选取所需波长的光。它是分光光度计的核心部件之一，通常由棱镜或光栅、狭缝等组成。

3.样品池（比色皿）：用于盛放待测样品溶液。紫外区测定时，需使用石英比色皿，因为玻璃会吸收紫外光；而在可见光区，玻璃比色皿或石英比色皿均可使用。比色皿有不同的光程长度，如1cm、2cm等，根据需要选择。

4.检测器：将透过样品池的光信号转换为可测量的电信号。常见的检测器有光电管、光电倍增管等。

5.信号处理与显示系统：将检测器输出的电信号进行放大、处理，并以吸光度（A）或透光率（T%）的形式显示出来，部分仪器还具备数据存储和简单的数据处理功能。

三、操作步骤指南

以常规的定量分析为例，紫外分光光度计的一般操作流程如下：

3.1开机预热

*确认仪器电源线连接正确，样品室中无异物。

*打开主机电源，根据仪器说明书要求进行预热。通常预热时间在15-30分钟，以确保光源和电子系统稳定。部分仪器可能需要先点亮特定光源。

3.2样品准备

*样品溶液的配制：根据分析方法的要求，准确配制待测样品溶液，确保溶液均匀、无气泡、无悬浮物。若样品浑浊，需进行过滤或离心处理。

*比色皿的准备：选择合适光程的石英比色皿。使用前，先用蒸馏水或待测溶液的溶剂冲洗比色皿内壁2-3次，以避免污染和浓度误差。注意拿取比色皿的磨砂面，避免触碰光学面，以免留下指纹影响透光。

3.3仪器参数设置

*波长选择：根据待测物质的吸收光谱特性或分析方法的规定，设置测定波长。通常选择最大吸收波长（λmax）作为测定波长，以获得最高的灵敏度和准确性。

*测量模式选择：选择吸光度（A）模式，这是定量分析中最常用的模式。

3.4空白校正（参比溶液校正）

空白校正的目的是消除溶剂、比色皿以及其他共存物质对光吸收的干扰。

*将装有空白溶液（通常为纯溶剂或不含待测组分的参比溶液）的比色皿小心放入样品室的比色皿架中，确保光路对准比色皿的光学面。

*盖上样品室盖，按“空白”或“调零”键，使仪器在当前波长下对空白溶液进行校正，此时仪器显示吸光度为零（或透光率为100%）。

*空白校正后，切勿再改变波长，否则需重新校正。

3.5样品测量

*将装有待测样品溶液的比色皿放入样品室的比色皿架中，确保放置位置正确。

*盖上样品室盖，待仪器显示稳定后，读取并记录吸光度值。

*为保证结果