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兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的制备及双夹心ELISA检测方法的构建与验证

一、引言

1.1研究背景

兔支气管败血症是家兔常见且危害严重的疾病，给养兔业带来了显著的经济损失。其病原为兔支气管败血波氏杆菌（Bordetellabronchiseptica），是一种革兰氏阴性、有鞭毛且能运动的细小杆菌，严格嗜氧，形态多样，从卵圆形至杆状不等，大小在0.5-1.5μm×0.2-0.4μm，常呈两极染色。在麦康凯培养基上，该菌生长良好，菌落大、圆整、突起、光洁、不透明，呈乳白色；在鲜血培养基上通常不溶血，但部分菌株具有溶血能力。该菌不发酵多种糖类，不形成吲哚，不产生硫化氢，却能分解尿素，枸橼酸盐利用试验和V-P试验呈阳性。

兔支气管败血波氏杆菌具有广泛的宿主范围，除家兔外，还能感染多种哺乳动物，如豚鼠、小鼠、犬、猫等，并在这些动物的上呼吸道中普遍存在，这使得慢性呼吸道疾病的交叉感染风险增加。当气候条件不利（如气候骤变）、兔的免疫力下降（如因感冒、寄生虫病等因素），以及兔舍环境不良（如通风不畅、卫生条件差、灰尘和刺激性气体较多）时，都极易引发兔支气管败血症的发生。

该疾病主要通过呼吸道感染，在气候多变的春秋两季尤为多发。当机体抵抗力降低，或受到其他诱因影响致使上呼吸道黏膜的保护屏障受损时，家兔就容易发病。其中，鼻炎型常呈地方性流行，支气管肺炎型多呈散发性。成年家兔多发生散发性、慢性支气管肺炎型，仔兔和青年兔则常呈急性支气管败血型，且幼兔的发病率和死亡率较高。

兔支气管败血症的临床表现主要分为鼻炎型和支气管肺炎型。鼻炎型在家兔中较为常见，多数病例表现为鼻腔流出少量浆液性或粘液性分泌物，通常不会变为脓性，当诱因消除后，症状可自行消失，但常出现鼻中隔萎缩。支气管肺炎型的特点是鼻炎长期不愈，病兔鼻腔流出粘液性或脓性分泌物，频繁打喷嚏，呼吸加快，食欲不振，逐渐消瘦，病程较长，一般经过7-60天可能死亡，也有些病兔可存活数月不死。病理变化方面，鼻炎型主要表现为鼻粘膜充血，有大量浆液或粘液性分泌物；支气管肺炎型主要病变为肺脏有局灶性暗红色炎性区，肺脏出现芝麻粒大至鸽蛋大的脓疱，数量不等，多者可占肺体积的90%以上，少数病例在肝脏及肾脏表面还会出现黄豆至蚕豆大的脓疱，脓疱内积满粘稠、乳油样乳白色或灰白色脓液。此外，严重时还可能出现小叶性肺炎或支气管肺炎，肺表面光滑、水肿，有暗红色突变区，切开后有少量液体流出。

目前，对于兔支气管败血症，尚无特效治疗方法，主要以预防为主。预防措施包括加强饲养管理，保持兔舍清洁卫生、通风良好，维持适宜的温度和湿度，减少各种应激因素的刺激；坚持自繁自养，若必须引进种兔，应严格做好检疫工作，隔离观察1个月以上，并进行细菌学与血清学检查，阴性者方可混群饲养；定期对兔舍、笼具、垫料以及工作服等进行消毒，可使用3%来苏尔溶液、1%-2%氢氧化钠液、1%-2%福尔马林液等消毒剂；定期接种疫苗，如用分离到的支气管败血波氏杆菌制成蜂胶或氢氧化铝灭活菌苗，进行预防注射，每只兔皮下注射1毫升，每年2次，也可用兔巴氏杆菌波氏杆菌二联苗进行免疫，皮下注射2毫升，免疫期限为4-6个月。

然而，现有的检测方法存在一定的局限性。传统的细菌学检查方法，如取呼吸道分泌物或病变组织进行涂片，使用革兰氏染色或美蓝染色进行显微镜检查，以及细菌分离培养等，操作繁琐、耗时长，且容易受到其他细菌的干扰。血清学检查方法，如平板凝集试验和琼脂免疫扩散试验等，虽然相对简便，但灵敏度和特异性有待提高。因此，开发高效、快速、灵敏、特异的检测方法对于兔支气管败血症的防控具有至关重要的意义。本研究旨在制备具有高亲和力和特异性的兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体，并建立一种高效、快速、特异性的双夹心ELISA检测方法，用于准确鉴定兔支气管败血波氏杆菌的存在和病原量，为兔支气管败血症的防控提供有力的技术支持。

1.2国内外研究现状

兔支气管败血波氏杆菌作为家兔支气管败血症的病原体，一直是国内外兽医学领域的研究重点。在国外，早在20世纪中期，科研人员就开始关注该病原菌的生物学特性研究，对其形态、培养特征、生化特性等方面进行了详细描述，为后续研究奠定了基础。随着分子生物学技术的发展，国外在兔支气管败血波氏杆菌的基因结构、致病机制等方面取得了显著进展。例如，通过基因测序技术，深入解析了该菌的毒力基因及其调控机制，明确了一些与粘附、侵袭相关的基因在致病过程中的关键作用，这为开发新型诊断方法和防控策略提供了理论依据。

在检测技术方面，国外较早开展了基于免疫学和分子生物学的检测方法研究。免疫荧光技术、放射免疫分析等免疫学方法被应用于兔支气管败血波氏杆菌的检测，这些方法在一定程度上提高了检测