CD163蛋白介导猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的氨基酸位点研究.pdfVIP

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）

是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome

virus，PRRSV）感染引起的一种严重影响养猪业的病毒传染性疾病。目前研究

发现，分化抗原163（clusterofdifferentiation163，CD163）是PRRSV感染的必

需受体，CD163蛋白中存在可介导PRRSV感染的有效氨基酸位点，但目前关于

CD163蛋白中有效氨基酸位点的报道较少。因此，为了探寻CD163蛋白中介导

PRRSV感染的有效氨基酸位点，本试验首先构建了CD163基因敲除的永生化猪

肺泡巨噬细胞系（immortalizedporcinealveolarmacrophages，iPAMs），随后在猪

肾细胞（porcinekidneycell，PK15）和CD163基因敲除的iPAMs中筛选有效抵

抗PRRSV感染的氨基酸位点，最后构建单氨基酸精准突变的iPAMs，并在该细

胞系上进行PRRSV的感染特征分析。主要研究结果如下：

1、本试验首先将靶向CD163基因第7外显子的sgRNA质粒（pX330-

sgCD163-1）转染至iPAMs，转染48h后通过有限稀释法分选单克隆细胞，并且

对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定、Westernblotting和脱靶分析来筛选

CD163基因敲除的iPAMs。测序结果显示筛选到一株CD163基因敲除的iPAMs

（-2bp/+1bp）；Westernblotting结果显示，CD163基因敲除的iPAMs中检测不

到CD163蛋白的表达，且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应；随后设置Mock

组、野生型iPAMs（WildTypeiPAMs，WTiPAMs）组和CD163基因敲除的

iPAMs（CD163geneknockoutiPAMs，KOiPAMs）组，并通过荧光定量试验

（quantitativepolymerasechainreaction，qPCR）、Westernblotting、间接免疫荧

光试验（indirectimmunofluorescenceassay，IFA）和半数细胞培养物感染量（50%

tissuecultureinfectivedose，TCID50）等试验证明CD163基因敲除的iPAMs可以

有效抵抗PRRSV的感染。此外本试验还通过Westernblotting试验探究了PRRSV

感染对细胞中核因子κB（nuclearfactorkappa-B，NF-κB）磷酸化的影响，结果

显示，相比于WTiPAMs组，Mock组和CD163基因敲除的iPAMs组中NF-κB

的磷酸化水平显著降低（P0.05）。

2、本试验在PK15细胞和CD163基因敲除的iPAMs中筛选可以有效抵抗

PRRSV感染的关键氨基酸位点。在PK15细胞中设置PK15-Mock组、PK15-

Vector组、PK15-WTOE组、PK15-570OE组、PK15-571OE组以及PK15-572

OE组，并且利用脂质体转染将构建的过表达质粒转染至PK15细胞中。随后通

过qPCR和Westernblotting来筛选抵抗PRRSV的氨基酸位点，结果显示，与

PK15-WTOE组相比，PK15-570OE组在病毒拷贝数和PRRSV-N蛋白的表达方

面均显著降低；在CD163基因敲除的iPAMs中设置KO-Mock组、KO-Vector组、

KO-WTOE组以及KO-570OE组，并再次验证第570位氨基酸位点突变的

CD163蛋白对PRRSV感染的影响，qPCR和Westernblotting试验结果显示，与

KO-WTOE组相比，KO-570OE组在病毒拷贝数和PRRSV-N蛋白的表达方面均

显著降低。

3、本试验通过CRISPR/Ca