生物化学实验技术 (2).pptVIP

4.DNA的提取从细胞中提取DNA，一般在细胞破碎后用浓盐法提取。即用1mol/L的氯化钠溶液从细胞匀浆中提取脱氧核糖核蛋白，再与含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质。或者先以0.14mol/L氯化钠溶液(也可用0.1mol/LNaCl加上0.05mol/L柠檬酸代替)反复洗涤除去核糖核蛋白后，再用1mol/L氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白，经氯仿戊醇(辛醇)或水饱和酚处理，除去蛋白质，而得到DNA。第62页，共86页，星期日，2025年，2月5日5.核酸的沉淀分离核酸分离纯化应维持在0-4℃的低温度条件下，以防止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。常用的沉淀分离法有：(1)有机溶剂沉淀法(2)等电点沉淀法(3)钙盐沉淀法(4)选择性溶剂沉淀法第63页，共86页，星期日，2025年，2月5日（7）金属离子蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法：①用无离子水或重蒸水配制试剂；②在配制的试剂中加入1-3mmol/L的EDTA(金属离子络合剂)。（8）抽提液与抽提物的比例在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以5∶1为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。第30页，共86页，星期日，2025年，2月5日Copyright?2010byOuyangHongsheng.Allrightsreserved.第二章沉淀技术郝林琳动物生物技术系吉林大学畜牧兽医学院Tel:0431第31页，共86页，星期日，2025年，2月5日概念沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。意义沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。基本原理根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。第32页，共86页，星期日，2025年，2月5日第一节蛋白质的沉淀分离一、盐析1.盐析的原理定义一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。原理盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。第33页，共86页，星期日，2025年，2月5日第34页，共86页，星期日，2025年，2月5日盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示：lg（S/S0）=-KsIS为蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L)；S0为蛋白质在离子强度为0时的溶解度；Ks为盐析常数；I为离子强度。第35页，共86页，星期日，2025年，2月5日在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数S0。故上式可改写为：lgS=lgS0–KsI=β–KsIβ=lgS0为一常数β值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH值有关；盐析常数Ks主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的结构有关，Ks越大，盐析效果越好。第36页，共86页，星期日，2025年，2月5日所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定(即β确定)，所采用的盐确定(即Ks确定)以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度I,I可用下式计算：I=1/2∑miZi2mi:溶液中离子的摩尔浓度Zi：离子的价数对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。第37页，共86页，星期日，2025年，2月5日2.盐的选择：蛋白质的盐析通常采用中性盐，