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细胞工程第五章植物细胞培养技术*第1页，共24页，星期日，2025年，2月5日第一节植物单细胞的分离一、由植物器官分离单细胞（一）机械法（二）酶解法两种方法的优缺点。二、由愈伤组织分离单细胞第2页，共24页，星期日，2025年，2月5日第二节单细胞培养技术一、植物单细胞培养的意义1、建立单细胞无性系。2、排除体细胞的干扰，有利于对细胞活动的观察。3、增加了无性繁殖的范围和潜力，提高了繁殖速度。4、许多杂合的重要经济植物通常是以无性方式繁殖-植物细胞培养。5、植物细胞培养在生物科学研究及提供医药产品等方面也有着广阔的情景。第3页，共24页，星期日，2025年，2月5日二、单细胞培养的方法（一）液体浅层培养（概念及其优缺点）（二）微室培养（微滴培养）（40-100μl）概念、用途、优缺点、要求（三）平板培养（图5-2）概念、优缺点（四）看护培养（图5-3）概念、用途、基本技术、要求、优缺点第4页，共24页，星期日，2025年，2月5日三、影响单细胞培养的因素1、植物因素2、培养基成分3、培养方式4、初始细胞植板密度（临界密度）5、生长激素6、pH7、CO2第5页，共24页，星期日，2025年，2月5日四、细胞培养注意事项1、实验前准备工作。2、保持气流通畅、操作规范。3、无菌操作。4、安全防护。5、设备维护。6、清场工作。第6页，共24页，星期日，2025年，2月5日第三节植物细胞悬浮培养植物细胞悬浮培养：将离体的植物或小的细胞团置于液体培养基中进行培养和生长的一种技术。一、细胞悬浮培养原理良好细胞悬浮培养应具备的三大特征。悬浮培养的两个基本特点悬浮培养的目的（生产次生代谢产物）第7页，共24页，星期日，2025年，2月5日二、培养方法（一）植物细胞悬浮培养的8大特性（二）植物细胞悬浮培养需要解决的6大问题（三）悬浮培养系统1、分批式培养（3个特点）2、流加式培养（4个特点，营养成分及其分类）3、半连续式培养（4个特点）4、连续式培养（优点，缺点及特点）5、灌流式培养第8页，共24页，星期日，2025年，2月5日三、悬浮系的建立与继代培养（一）悬浮系的制备成功悬浮细胞培养体系必须满足的三个条件（二）继代培养1.继代培养的方法和最佳时机2.细胞生长曲线（图5-5细胞的生长周期曲线）3.五个时期的特点讨论及注意事项第9页，共24页，星期日，2025年，2月5日第10页，共24页，星期日，2025年，2月5日四、悬浮培养细胞的同步化（一）物理方法1、分选法2、冷处理法（二）化学方法1、饥饿法2、抑制剂法3、有丝分裂阻抑第11页，共24页，星期日，2025年，2月5日五、细胞增殖的测定（一）细胞计数法（二）细胞密实体积（PCV）（三）细胞生物量计算法1、直接称量2、干重法（四）植板率（五）细胞大小测量第12页，共24页，星期日，2025年，2月5日六、培养细胞活力的检查1、酚藏花红溶液染色法2、相差显微术法（胞质环流法）3、TTC法4、FDA染色法5、伊凡蓝法6、细胞再生能力的鉴定第13页，共24页，星期日，2025年，2月5日第四节植物细胞的规模培养一、概述（一）植物细胞培养意义（4个）（二）植物细胞培养的优势（三）规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径1、保护生态环境2、提高生产效率3、发展新型生物技术产业（生物制药）第14页，共24页，星期日，2025年，2月5日二、植物细胞规模化培养体系的建立（一）植物细胞大规模培养的技术要求（1、培养的细胞在遗传上是稳定的，以得到产量恒定的产物。2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量终产物。3、代谢产物要在细胞内积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。第15页，共24页，星期日，2025年，2月5日（二）植物细胞规模培养技术3个要点1、细胞系的建立和选择2、优良细胞系的增殖培养3、大规模培养体系的建立（一步法逐级放大、两步法、固相培养-两步法）（三）培养方式的选择1、悬浮细胞培养2、固定化细胞培养（常用的固定化方法、固定化培养实例、植物细胞自生固定化）第16页，共24页，星期日，2025年，2月5日三、生物反应器类型及特点（一）植物细胞悬浮培养生物反应器主要类型及其特点（优缺点，图5-6）1、搅拌式生物反应器2、气泡柱式反应器3、气升式反应器第17页，共24页，星期日，2025年，2月5日