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人类外周血培养及染色体核型分析

一、实验目的：

1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；

2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；

3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。

二、实验原理：

1、植物血凝素的作用

外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养

基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进

行有丝分裂。

2、秋水仙素的作用：

秋水仙素(colchicines)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。

因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。

使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要

合适。

3、低渗的原理：

徐道觉(T.C.Hsu)等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细

胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染

色效果也明显提高。

这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。

4、核型和带型：

核型(karyotype)：

是指染色体组在有丝分裂中期的表型,是染色体数目、大小、形态特征的总和。

在对染色体进行测量计算的基础上,进行分组、排队、配对,并进行形态分析的过

程叫核型分析。

将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来

的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。

带型（bandingpattern）

即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。

染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的

分带模式，即称带型。

常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。就每一种分带技术

而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。

三、实验用具及试剂：

1.实验仪器及用具：

恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体

分析仪；

培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。

2.实验试剂：

外周血淋巴细胞培养基

2%碘酒

75%酒精

20µg/ml秋水仙素

0.075mol/LKCl溶液

甲醇

冰醋酸

Giemsa原液

1/15mol/L磷酸缓冲液

四、实验步骤：

1、采血：将皮肤常规消毒后静脉采血约0.5ml。

2、种血及培养：将采到的血样立即接种到培养瓶内，每个培养瓶接25－28滴（约0.5ml），

轻轻摇匀后将培养瓶放在37℃温箱中培养72小时。培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养

瓶。

3、秋水仙素处理：在终止培养前4小时，向培养瓶中加20µg/ml的秋水仙素20µl，轻轻

摇匀后继续培养到72小时。

4、制片：

（1）离心：从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转入10ml的刻度离心管内。2000转/

分，离心10分钟。

（2）低渗：弃去上清液。加入37℃预热的

0.075mol/LKCl低渗液6-8ml，用吸管轻轻吹打均匀，放在37℃恒温水浴中30分钟。(此时

配固定液：甲醇225ml+冰醋酸75ml)

（3）预固定：在离心管中加入现配的预温的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液约1ml，轻轻混匀,37℃

固定15分钟。

（4）再次离心：2000转/分离心10分钟。

（5）第一次固定：弃上清液，加入固定液约7ml，立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温

固定20分钟。2000转/分离心10分钟。

（6）第二次固定：同第一次固定。

（7）弃上清液，根据沉淀量的多少，加入适量固定液6～8滴，用吸管吹打使均匀后制成

细胞悬液。

（8）滴片：在10-15cm高处将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，注意动作应迅速，避免载

片升温。

（9）染色：用10%吉姆萨染液扣染30分钟，染色结束后用清水将浮色冲去，干燥后即可

进行镜检。

（10）照相：在显微镜下寻找分散较好的分裂相(核型)，再置于显微照相仪下拍摄照片，并