转化子筛选和鉴定上海农林86课件.pptVIP

生物医药与健康系刘影转化子筛选和鉴定上海农林职业技术学院

CONTENTS目录01载体的概念、种类02载体的条件、功能03质粒质粒载体的构建载体遗传标记检测克隆DNA序列检测外源基因产物检测

由于重组率和转化率不可能达到100%，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子.转化子:导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。

转化子的筛选和鉴定方法载体遗传标记检测克隆DNA序列检测外源基因产物检测

载体遗传标记检测1抗药性筛选法原理：将外源DNA片段插在XbaI位点：非重组子抗性Ampr、Kanr重组子抗性Kanr

载体遗传标记检测抗药性筛选法基本操作：先将转化液涂布含有Kan的平板将Kan平板上的转化子影印至含有Amp和Kan的平板上在Kan平板上生长、但在Amp和Kan平板上不长的转化子即为重组子

载体遗传标记检测2营养缺陷型筛选法基本原理：可以区分转化子与非转化子一般不能区分重组子与非重组子。原理：载体分子上携带合成某种营养组份的基因，受体细胞本身不能合成这一营养组份将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子

载体遗传标记检测3显色筛选法显色筛选法的基本原理：原理：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于筛选。如lacZ’基因（蓝色反应）链霉菌质粒pIJ702携带的酪氨酸酶（melC）基因（黑色反应），催化生成由酪氨酸氧化而来的黑色素。

载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法的基本操作：将外源基因克隆在载体的lacZ’基因内部，使之失活重组子呈Kanr、lacZ-，菌落白色非重组子则呈Kanr、lacZ+，菌落蓝色。

1限制性酶切图谱法就是对插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并与已知目的基因的酶切图谱对比。克隆DNA序列检测

限制性酶切图谱法全酶解图谱法：用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段重组DNA分子：2kb;2.7kb非重组DNA分子：2.7kb

限制性酶切图谱法全酶解图谱法：用EcoRI酶切转化子质粒DNA目的重组子：1.5kb;3.2kb或者：0.5kb;4.2kb2.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIBamHIBamHIEcoRIPstI2kb0.5kb0.3kb

克隆DNA序列检测探针：同位素标记菌落原位杂交法的基本操作：2菌落原位杂交法

克隆DNA序列检测菌落原位杂交法杂交探针的标记：荧光标记探针A-T-G-A-G-C-C-A-T-C-C-G-A-GT-A-C-T-C-G-G-T-A-G-G-C-T-C样本T-A-C-T-C-G-G-T-A-G-G-C-T-CA-T-G-A-G-C-C-A-T-C-C-G-A-G荧光基团

菌落原位杂交法

菌落原位杂交法

克隆DNA序列检测3DNA序列分析法Sanger双脱氧末端终止测序法Maxam-Gilbert化学修饰法杂交测序法

Sanger双脱氧末端终止测序法

Maxam-Gilbert化学修饰法

杂交测序法

外源基因产物检测1蛋白质生物功能测定法淀粉酶基因的鉴定：淀粉酶能水解淀粉蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定

外源基因产物检测2聚丙烯酰胺凝胶电泳法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进粗略的筛选。裂解菌体电泳根据表达蛋白质分子量