免疫印迹(WB)实验操作具体步骤及详细说明.pptxVIP

2025/07/13

免疫印迹(WB)实验操作

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CONTENTS

目录

01

实验前的准备工作

02

免疫印迹实验步骤

03

实验注意事项

04

实验结果分析

实验前的准备工作

01

实验材料准备

准备实验耗材

包括移液管、离心管、滤纸等，确保实验过程中耗材的充足和质量。

配置实验试剂

根据实验需求，提前配置好所需的电泳缓冲液、转膜液等试剂，保证实验顺利进行。

实验设备检查

检查电泳槽

确保电泳槽无泄漏，电极连接正确，以保证蛋白质分离顺利进行。

确认转膜装置

检查转膜装置是否完好，包括转膜夹板、海绵垫和滤纸，确保转膜过程无误。

校验凝胶成像系统

检查凝胶成像系统是否正常工作，包括光源、相机和软件，以确保实验结果准确记录。

样品制备

收集实验样本

根据实验需求，从组织、细胞或血液中提取样本，确保样本新鲜且未受污染。

样本的裂解

使用适当的裂解缓冲液和方法破碎细胞，释放出蛋白质，以便进行后续的电泳分析。

蛋白质定量

采用BCA或Bradford等方法测定样本中的总蛋白浓度，确保实验的准确性。

样品的处理和保存

对样本进行去污剂处理，去除核酸和多糖，然后分装并保存于-80°C，以备后续使用。

免疫印迹实验步骤

02

蛋白质样品的分离

样品制备

将细胞或组织样本破碎，提取总蛋白，为后续的电泳分离做准备。

SDS电泳

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量大小进行分离，形成条带。

转膜过程

将分离后的蛋白质条带转移到膜上，为后续的免疫检测做准备。

转膜过程

准备转膜缓冲液

在转膜前，需配制适当的转膜缓冲液，以确保蛋白质从凝胶有效转移到膜上。

选择合适的转膜膜

根据目标蛋白的大小和性质选择PVDF或硝酸纤维素膜，以提高转膜效率和特异性。

组装转膜夹层

将凝胶、转膜膜和滤纸按照正确的顺序放置在转膜夹层中，确保无气泡，准备进行电转。

电转操作

将组装好的转膜夹层放入电转槽中，施加适当的电流和时间，完成蛋白质的转移过程。

封闭与抗体孵育

准备实验耗材

包括移液管、离心管、滤纸等，确保实验过程中耗材的充足和质量。

配置实验试剂

根据实验需求，提前配置好所需的电泳缓冲液、转膜液等试剂，并进行适当标记。

显色与结果检测

检查电泳槽

确保电泳槽无泄漏，电极连接正确，以保证蛋白质分离效果。

确认转膜装置

检查转膜装置是否完好，包括转膜夹、海绵垫和滤纸，确保转膜过程顺利。

校验凝胶成像系统

检查凝胶成像系统是否正常工作，包括光源、相机和软件，以获得准确的实验结果。

实验注意事项

03

实验操作细节

样品制备

将细胞或组织样本破碎，提取总蛋白，为后续的电泳分离做准备。

SDS电泳

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量大小进行分离，形成条带。

转膜

将分离后的蛋白质条带从凝胶转移到膜上，为后续的免疫检测做准备。

常见问题及解决方法

准备实验耗材

包括移液管、离心管、滤纸等，确保实验过程中耗材的充足和质量。

配置实验试剂

根据实验需求，提前配置好所需的电泳缓冲液、转膜液等试剂，并进行适当标记。

实验结果分析

04

结果的解读

样品的采集

根据实验需求，准确采集组织或细胞样本，确保样本新鲜且未受污染。

样品的处理

将采集的样品进行匀浆、离心等处理，以获得适合WB实验的蛋白质提取物。

蛋白质定量

使用BCA或Bradford方法对样品中的蛋白质进行定量，确保后续实验的准确性。

样品的保存

将处理好的样品分装并保存在-80°C冰箱中，避免反复冻融影响蛋白质质量。

数据处理方法

准备转膜缓冲液

在转膜前，需配制适当的转膜缓冲液，以确保蛋白质从凝胶有效转移到膜上。

选择合适的转膜膜

根据目标蛋白的大小和性质选择PVDF或硝酸纤维素膜，以提高转膜效率和特异性。

组装转膜夹层

将凝胶、转膜膜和滤纸按照正确的顺序放置在转膜夹层中，确保无气泡，准备进行转膜。

控制转膜时间和电压

根据蛋白的大小和膜的类型，设定适宜的转膜时间和电压，以获得最佳的转膜效果。

THEEND

谢谢