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新生鼠脑缺血预处理后海马CA1区GAP

【摘要】目的：观察新生Wistar鼠脑缺血再灌注后海马CA1区生长相关蛋白43的表达和意义.方法：通过阻断7日龄新生Wistar大鼠右侧颈总动脉45min制备脑缺血模型，设置假手术组、缺血再灌注组和预缺血缺血再灌注组.采用免疫组化方法和计算机图像分析技术检测三组新生鼠不同时点海马CA1区脑组织GAP43的动态变化及三组光镜下脑组织病理改变.结果：①脑组织病理改变：假手术组大鼠无异常病理改变，缺血再灌注组神经细胞变性、坏死，预缺血组病理损伤较缺血再灌注组轻.②GAP43表达：缺血再灌注组海马GAP43表达在再灌注后24h时开始增高，7d达高峰，至14d与假手术组比较差异有统计学意义；预缺血缺血再灌注组GAP43表达较缺血再灌注组增加更明显，与假手术组和缺血再灌注组比较均差异有统计学意义.结论：新生鼠脑缺血预处理可减轻再次严重脑缺血对神经细胞的损伤，脑缺血预处理后海马CA1区GAP43表达和合成增加，GAP43表达增加可能与神经元再生和轴突重塑有关，是脑缺血后神经细胞内源性代偿机制之一.

【关键词】脑缺血;缺血预处理；生长相关蛋白43；海马；Wistar大鼠；新生

0引言

神经生长相关蛋白43(growthassociatedprotein43,GAP43)是一种神经细胞膜上的特异性磷蛋白，在神经系统的发育和损伤再生中，常能检测到GAP43在mRNA和蛋白水平上的明显升高，被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子［1］，在神经发育和再生过程中呈现高表达，能调节神经元对轴突引导信号的反应，在引导轴突生长和调节轴突形成新的联系上起关键作用，是神经元发育和可塑性的分子标志物［2］，GAP43基因敲除大鼠其神经发育障碍［3］.研究发现，一次短暂的脑缺血可明显减轻再次严重缺血造成的神经元损害，此现象称脑缺血预处理或缺血耐受［4］，对防止器官因再次严重缺血造成的损伤有保护作用.本研究我们观察了新生鼠脑缺血预处理对海马CA1区GAP43表达的影响，探讨GAP43在新生鼠脑缺血后神经细胞反应性再生、结构重建以修复损伤的作用.

1材料和方法

材料生后7dWistar大鼠，体质量18~22g，共90只，雌雄不拘，随机分为假手术组、缺血再灌注组、预缺血缺血再灌注组.每只鼠用1000U青霉素腹腔注射预防感染，用30g/L戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔注射麻醉.抗GAP43抗体，购自武汉博士德公司，兔抗鼠多克隆抗体，编号为BA0878.

方法

脑缺血模型的制作假手术组:分离右侧颈总动脉，不阻断血流；缺血再灌注组：阻断右侧颈总动脉45min再灌注；预缺血缺血再灌注组：微小止血夹阻断右侧颈总动脉8min，恢复灌注24h，再次阻断同侧颈总动脉45min.三组均于术后3h，12h，24h，3d，7d，14d断头处死，取右侧大脑半球用40g/L多聚甲醛固定待测；6个时点，每个时点5只，每组30只，共90只.判断脑缺血模型成功标准：结扎右侧颈总动脉后2h对侧(左侧)肢体活动障碍.

海马切片的制备及GAP43的检测(免疫组织化学Envision二步法)取各实验组大鼠右侧大脑半球用40g/L多聚甲醛固定12h，石蜡包埋，进行海马CA1区、皮层连续冠状切片，片厚4μm.切片常规脱蜡和水化，蒸馏水漂洗后置于PBS中，用30mL/L过氧化氢避光孵育20min以阻断内源性过氧化物酶，PBS漂洗5min×3次，加20μL一抗，37℃孵育30min，PBS漂洗5min×3次，加20μL相应的EnvisionTM复合物，37℃孵育30min，PBS漂洗5min×3次，DAB显色，蒸馏水漂洗，封片.以PBS代替一抗作阴性对照.

图像分析用Mias992B图像分析系统(四川大学图象图形研究所研制)测量切片海马CA1区GAP43A值，每只鼠3张切片，每张切片测2次，每次所测面积50%海马CA1区，取其平均值作为GAP43的A值；同时测定同一张切片上胼胝体的光密度值作为其背景值.实测值减去背景值得矫正吸光度(CA)，用CA值进行比较和分析，以避免染色过程中非特异性染色所造成的误差.

脑组织病理学检查取相应部位切片行HE染色，观察其病理学改变.

统计学处理：数据以x±s表示，用SPSS统计软件进行分析，采用单因素方差分析，并结合LSD检验进行两两均数比较；为差异有显着性.

2结果

病理学改变假手术组未见神经元损伤，缺血灌注组大鼠海马CA1区神经细胞自缺血12h开始可见水肿、神经细胞灶性液化性坏死及胶质细胞浸润，以第3日为最重；预缺血组海马CA1区神经细胞病理改变较缺血灌注组轻，可见神