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常用细胞培养技术2025/7/171

2025/7/172一、细胞生长状况有关指标及检测方法1）细胞计数（略）2）细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是测定细胞绝对增长和繁殖规律的常用方法。方法1同规格的培养瓶，接种等量、同代细胞培养每24小时取出几瓶细胞计数培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数的对数为纵坐标，标出各点连成线，即为生长曲线。2025/7/17

2025/7/173方法2：用96孔/24孔培养板，分7组，每组3孔，接种培养一周(7天)，逐日检测一组，计数7天细胞对数值绘成图---细胞生长曲线。标准的细胞生长曲线近似“S”形2025/7/173

2025/7/174绘制生长曲线注意事项接种浓度适宜，要求7~10天长满，1~5x104个/mL。不同孔/瓶接种密度等所有条件相同。生长曲线上（对数生长期），细胞数量增加1倍所需要的时间，称为细胞倍增时间。细胞生长倍数=培养后最大活细胞浓度/接种时活细胞浓度2025/7/17

2025/7/1753）细胞分裂指数以1000个细胞中的分裂细胞数，表示细胞增殖旺盛程度。4）细胞接种存活率---又称细胞贴壁率细胞悬液接种后，贴壁细胞百分数值。基本步骤：（1）对数生长期细胞悬液，计数，接种12～15个培养瓶。（2）每2小时取一瓶，倒掉培养液，消化贴壁细胞，计数，计算每个时间的贴壁率。共观察24小时即12次。接种存活率%(贴壁率)=(贴壁存活细胞数/接种细胞数)×100%2025/7/17

2025/7/1765）克隆形成率细胞接种存活率：只表示接种后贴壁细胞数；贴壁细胞不一定每个都增殖和形成克隆。形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。细胞生物学性状不同，克隆形成率差别很大初代培养：弱，传代细胞：强；二倍体细胞：弱，转化细胞：强；正常：弱，肿瘤细胞：强。贴壁细胞形成克隆细胞2025/7/17

2025/7/177平板克隆形成试验=〉对数生长期细胞=〉每皿接种50、100、200个细胞，培养2～3周=〉培养肉眼可见克隆=〉弃上清，PBS洗2次=〉纯甲醇或1:3醋酸/甲醇固定15分钟=〉去固定液，Giemsa染10～30分钟2025/7/17

2025/7/178=〉流水冲洗，空气干燥=〉平皿倒置，用带网格透明胶片计克隆数；或在显微镜计大于10个细胞的克隆数。计算克隆形成率：克隆数克隆形成率=—————×100%接种细胞数

2025/7/1792025/7/170.7%琼脂+2*M+Cell1.2%琼脂+2*M10～14天软琼脂培养克隆形成试验

2025/7/17106）细胞的活力检测原理细胞损伤或死亡时，某些染料可穿过细胞膜，与DNA结合，使其着色。活细胞能阻止这类染料进入细胞因此可鉴别死细胞和活细胞。常用染料2025/7/17

2025/7/1711台盼蓝：浓度0.5%～1%与细胞悬液等比混合，1-3min；死细胞蓝色，活细胞透明不着色。苯胺黑：浓度0.05%；与细胞悬液1:10混合；稍后，死细胞黑色，活细胞不着色。结晶紫：浓度0.1%；等比混合，立即镜检，活细胞紫色。4大格活细胞数4大格活细胞+死细胞数х100%细胞存活率=2025/7/17

2025/7/1712二、细胞的运输由于培养细胞株(系)的商品化，细胞培养室之间的交流、交换和购买=〉必须细胞的运输.否则影响细胞的生长污染培养失败等。

2025/7/1713运输方法一）冷冻储存运输利用特殊容器内盛液氮或干冰的运输方法。优点：保存效果较好；缺点：比较麻烦，不宜长时间运输，多需空运，代价较大。

2025/7/1714二）充液法生长良好，覆盖1/3～1/2瓶底；去旧培养液，补新培养液至瓶颈，保留微量空气拧紧瓶盖，胶带密封。放盒内，棉花等做防震防压处理。运输4～5天：一般放贴身口袋即可。到达后倒出多余培养液，保留生长所需培养液。37℃培养，次日传代。数小时运输：可将细胞面朝上，或把培养液全部倒掉放在胸部口袋运送。

2025/7/1715三、病毒的细胞培养

2025/7/1716一）用细胞培养分离、繁殖病毒(一)接种标本的处理：1、粪便标本取样：肛门沾取/死动物肠道乳化：带玻璃珠试管中，2g+15mLHank,s2500rpm15min，上清8层纱布过滤滤液4℃10000rpm1h1.8mL上清+0.2mL抗生素液（双抗2.5万U/mL,两性霉素B250mg/L)，4