DB1302T 318-2011 水产品中孔雀石绿的快速测定 酶联免疫吸附法.docxVIP

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DB130

DB1302/T318—2011唐 山 市 地 方 标 准

DB1302/T318—2011

水产品中孔雀石绿的快速测定

酶联免疫吸附法

2011-11-01发布 2011-12-01实施

唐山市质量技术监督局 发布

DB1302/T318—2011

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前 言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由唐山市质量技术监督局提出。

本标准起草单位：唐山市畜牧水产品质量监测中心。

本标准起草人：张建民、蒙君丽、葛怀礼、李爱军、苗建民、董李学、肖琎、陈秋江、张兰稳、张瑞宝。

DB1302/T318—2011

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水产品中孔雀石绿的快速测定 酶联免疫吸附法

范围

本标准规定了水产品中孔雀石绿残留量的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于快速测定水产品中孔雀石绿的残留量。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682 分析实验室用水规则和试验方法

制样

样品的制备

取新鲜或解冻的供试水产品组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。

样品的保存

-20℃冰箱中贮存备用。

测定方法

方法原理

利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的孔雀石绿进行免疫测定。经过前处理的样品溶液到包被有抗体的测试孔，样品中的孔雀石绿和酶标记物竞争与抗体结合，结合的酶标记物加入底物后，终止反应，在450nm处测定。吸光度值与试样中孔雀石绿浓度的自然对数成反比，与标准曲线比较再乘以稀释倍数，即可得出样品中孔雀石绿的含量。

试剂和材料

以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682规定的二级水。

孔雀石绿检测试剂盒：2℃～8℃冰箱保存。

乙腈。

4.2.3 中性氧化铝：100目-200目（孔径150μm～75μm）。

仪器和设备

酶标仪：配备450nm滤光片。

均质器。

天平：感量0.01g。

振荡器或混旋器。

离心机：转速4000r/min，带50mL离心管。

氮气吹干装置。

微量移液器：单道20μL～200μL、200μL～1000μL，多道50μL～300μL。

计时器。

4.3.9恒温培养箱（0℃～50℃）。

样品提取

称取5.00g已均质样品于50mL离心管中，加入10mL乙腈，充分振荡，于离心机中离心，3000rpm5min。加入3g中性氧化铝（100-200目），于离心机中离心，3000rpm5min。移取上清液2mL于5mL离心管中，氮气吹干。加入0.5mL稀释好的复溶工作液（试剂盒自带），混合3s，然后静置30min。称取0.1g复溶试剂（试剂盒自带）加入到上述5mL离心管中，混合3s，然后静置10min。取50μL上清液加入0.95mL样品稀释液1：20稀释并混匀。移取120μL进行分析。

试样测定

取出试剂盒中所有试剂及试验需要数量的微孔板条，插入框架，使其回温至室温（19℃～25℃），回温至少15min。

给编好号的混合微孔加入120μL的标准液、样品，每个样本和标准品做2孔平行。

使用多道移液器，每孔快速加入120μL酶标记物到每个孔中混合至少10s。

从混合孔中吸取200μL混合液到相应的测试孔中，室温下避光静置孵育30min。

甩出孔中液体，每孔每次用250μL洗涤液冲洗，洗液不得溢出，连洗3～5次，每次都要倒掉孔内液体并在吸水纸上拍干，保证完全除去孔中液体。

使用多道移液器，每个微孔中加入100μL底物溶液，室温下避光静置孵育30min。

每个微孔加入100μL终止液。

轻轻振荡混匀，用酶标仪在450nm波长处读取吸光度值。

结果判定与表述

标准品或样本的百分吸光度值等于标准溶液或样本溶液的平均吸光度值（双孔）除以空白标准溶液的平均吸光度值，再乘以100%，见式（1）

百分吸光度值（%）=B/B0ⅹ100% （1）

式中：

B——标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0——空白标准溶液的平均吸光度值

然后以标准品浓度的对数为横坐标，以标准品百分吸光值为纵坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。将样本的百分吸光值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中孔雀石绿的实际残留量。也可利用试剂盒专业分析软件进行计算，样本准确、快速的分析出结果。

方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法确证。

灵敏度、检测限、回收率

灵