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实验一蛋白质的吸光分析测定张亚东谭理
实验目的通过实验使学生掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理、实验步骤了解改良lowry法、Coomassie亮蓝法、紫外分光光度法测定蛋白浓度的区别、优缺点以及适用范围。0102
实验原理No.3改良Lowry法在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物。（双缩脲反应）蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。（还原反应）No.2No.1
改良lowry法的原理图650nm
Coomassie亮蓝法Coomassie亮蓝G250能与蛋白质的疏水区域结合，这种结合具有高度敏感性，G250与蛋白质形成的复合物成蓝色，在595nm处有最大吸收峰，颜色深浅与蛋白质浓度成正比关系，通过建立标准曲线可测定未知蛋白浓度。
紫外分光光度法有些蛋白质组成中常含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm处有最大吸收峰，故可根据280nm处的吸光度的大小来测定这类蛋白质的含量。在生物样品中还可能会含有核酸等成分，在280nm处也有吸收，它的最大吸收峰在260nm可通过经验公式排除核酸的影响蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260
logo波长260280
改良Lowry法编号123456测定管蛋白含量ug/ml17.535701051400未知标准溶液、样品ml1.01.01.01.01.0-1.0生理盐水ml-----1.0-试剂Aml0.90.90.90.90.90.90.9
混匀后置于50度水浴中保温10分钟，冷却室温放置10分钟立即混匀，置于50度水浴中保温10分钟，冷却后在650nm处比色试剂Bml0.10.10.10.10.10.10.1试剂Cml3.03.03.03.03.03.03.0
改良Lowry法蛋白质浓度测定制备标准曲线，根据测定管的OD650nm值计算未知蛋白质浓度
Coomassie亮蓝法管号123456测定管蛋白质含量ug/ml50025012562.531.250未知标准溶液ml0.10.10.10.10.1－－生理盐水ml－－－－－0.1－样品ml－－－－－－0.1染液ml5555555
制备标准曲线，根据测定管的OD595nm值计算未知蛋白质浓度摇匀，室温静置3分钟，以第六管为对照，于595nm波长比色，读取吸光度。
取待测样品稀释液，以蒸馏水为对照，在紫外分光光度计上分别测定OD280nm和OD260nm的吸光度值，根据经验公式计算蛋白浓度1蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A2602紫外分光光度法
实验讨论和注意事项比色法是常用的测定浓度的方法，其关键点在于标准曲线的制备一定要精确。标准样品的配置浓度是否精确直接影响实验的结果，因此要正确掌握加样枪、移液管的操作，保证标准样品配置的准确。01对于分光光度计的使用要正确掌握，注意调节波长。正确的进行仪器的调试和测定，保证结果的准确。02
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