大型海藻附生和内生细菌分离鉴定方法.docVIP

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ICS

FORMTEXT65.150

CCS

FORMTEXTB51

FORMTEXT37

FORMTEXT山东省地方标准

DBFORMTEXT37/TFORMTEXTXXXX—FORMTEXTXXXX

FORMTEXT?????

FORMTEXT大型海藻附生和内生细菌分离鉴定方法

FORMTEXTMethodfortheseparationandidentificationofepiphyticandendophyticbacteriaofmacroalgae

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施

FORMTEXT山东省市场监督管理局??发布

STYLEREF标准文件_文件编号DB37/TXXXX—XXXX

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由山东省海洋局提出并组织实施。

本文件由山东省海洋标准化技术委员会归口。

大型海藻附生和内生细菌分离鉴定方法

范围

本文件描述了大型海藻附生和内生细菌分离纯化、鉴定和保藏的方法。

本文件适用于大型海藻附生和内生细菌的分离鉴定。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T30744—2014深海微生物样品前处理技术规范

DB37/T4092—2020鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

大型海藻macroalgae

肉眼可见的、绝大多数是多细胞的丝状体、膜状体、管状体或叶状体植物。

主要包括红藻、绿藻和褐藻。

附生细菌epiphyticbacteria

定殖于大型海藻藻体表面的细菌。

内生细菌endophyticbacteria

生长在大型海藻藻体内部的细菌。

试剂与耗材

试剂

无菌1×PBS缓冲液：2?mMKH2PO4，0.137?MNaCl，10?mMNa2HPO4，2.7?mMKCl。

陈海水：天然海水避光保存三周及以上，使用时经孔径0.45?μm滤膜过滤的滤液。

超纯水：符合GB/T6682—2008中一级水要求。

酒精：75％乙醇。

次氯酸钠溶液：浓度2.5％。

生理盐水：0.9％的NaCl溶液。

经121?℃，20?min灭菌处理。

保种液。

向配置好的0.9％的NaCl溶液中添加甘油，至终浓度为15％（V/V），将配置好的保种液置于封闭容器储存。121?℃，20?min灭菌处理。

Zobell2216E培养基：5.0?g蛋白胨，1.0?g酵母膏，0.01?gFePO4，20.0?g琼脂（固体培养基添加），1?000?mL陈海水，pH7.4～7.8。

121?℃灭菌20?min。

无菌液体石蜡。

耗材

细菌基因组DNA提取试剂盒（市售）。

枪头：材料为聚丙烯的微量加样器套头，规格为0.2?mL、1.0?mL和5.0?mL。

冻存管：材料为聚丙烯，或其它可耐121?℃高温和液氮的塑料管，容积大于或等于2.5?mL。

其他生物实验常用耗材：纱布、封口膜。

仪器与设备

生化培养箱：培养室温度能在0?℃～60?℃范围内调节。

振荡培养箱：培养室温度能在0?℃～60?℃范围内调节，转速能在0?r/min～300?r/min范围内调节。

电子天平：精度为0.01?g。

玻璃试管：直径×长度为18?mm×180?mm的平口玻璃试管和直径×长度为15?mm×150?mm的平口玻璃试管。

锥形瓶：容量为250?mL的广口玻璃锥形瓶。

脉冲场电泳仪系统：最高输出电压350?V，电压连续可调，最大输出电流0.5?A，转换范围50?ms到18?h，转换角度为0°～360°，包括电泳仪、水浴循环仪和电冰槽。

其他生物实验常规仪器：超净工作台、漩涡振荡器、高压灭菌锅和酒精灯等。

藻类样品采集与处理

样品采集

采用随机抽样的方法，选取生长状态良好、长势一致的藻类样本，每株样本的重量约为30?g；样本处理前应置于原位海水中或在4?℃冰箱中保存（不超过24?h），2?h内处理分析。

用121?℃，20?min灭菌过滤后的海水洗涤清除藻体表