蛋白质与酶工程【共43张PPT】.pptVIP

2、对蛋白酶的抵抗力提高氨基酰化酶：在胰蛋白酶作用下活力仅存20％，而将其固定于DEAE－纤维素上在同样条件下仍有80％的活力。3、对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高氨基酰化酶：溶液酶在6mol、2mol弧、1％SDS和4mmol丙酮溶液中相对活力分别为9％、49％、1％和55％，而后者在相应溶液中相对活力则分别为146%、117%、35%和138%。4、操作稳定性提高固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期较长。青霉素酰化酶：37℃催化77天，活力仍为100%5、贮藏稳定性提高木瓜蛋白酶：在4℃下，120天溶液酶活力只保留有70%，而固定化酶（琼脂）活力无变化。三、固定化酶的催化特性改变1、最适温度固定化酶反应的温度一般较溶液酶的高，如用CM-纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比溶液酶高5~15℃。（但也有例外）2、最适pH最适pH的变动依据载体的电荷性质而定。带负电荷载体：最适pH向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH向酸性偏移。DEAE-纤维素或DEAE-葡聚糖固定化氨基酰化酶与其游离酶比较，低0.5个pH而偏向酸性方向。CM-纤维素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最适pH与游离酶比较，向碱性方向偏移0.5~1个pH单位。3、Km（反应动力学）多数固定化酶的Km有一定变化，与活性中心的构象改变及载体的电荷性质有关。载体与底物电荷相反，固定化酶的Km值降低。载体与底物电荷相同，固定化酶的Km值显著增加。4、专一性大多数固定化酶的专一性与溶液酶相同，但也有例外。优选蛋白质与酶工程二、酶的固定化方法吸附法、共价结合法、交联法、包埋法1、吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。①物理吸附法通过氢键、疏水作用和、π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶。常用的载体有：有机载体：纤维素(玻璃纸或胶棉膜)、淀粉等，吸附量大无机载体：氧化铅、皂土、多孔玻璃等，吸附量小，易脱落②离子交换吸附法将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化。阴离子交换剂：二乙基氨基乙基（DEAE）-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶DEAE-SephadexA25固定氨基酰化酶：溶胀，然后用0.5mol/LNaOH和水洗涤，加酶混匀，于低温下搅拌过夜，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol／L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。阳离子交换剂：羧甲基（CM）-纤维素吸附法的优点：a、操作简单；b、载体选择范围广；c、吸附过程可以同时纯化酶；d、固定化酶在使用过程失活后可重新活化；e、载体可以回收再利用。吸附法的缺点：a、由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大。b、由于吸附法制备的固定化酶酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作稳定性。2、包理法包埋法是将载体聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂（包括交联剂）的作用进行单体聚合，酶被包埋在载体聚合物中以达到固定化。分为凝胶包理法和微囊包埋法①凝胶包理法凝胶包埋法（基质包埋法）是将酶分子包埋在凝胶网络的格子中。海藻酸钙凝胶（海藻酸钠）、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、卡拉胶②微囊包埋法微囊包埋法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。此法在医疗上极为有用人造细胞、红血球包埋法、脂质体包埋法……包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法。优点：①操作简单，条件温和；②无反应，不改变酶的空间结构，固定化酶的活力高；③适用性广。缺点：①只适宜于小分子底物，对大分子底物不适宜；②凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化。3、共价结合法（共价偶联法）就是酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落。缺点：但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。①酶分子和载体连接的功能基团酶分子：-NH3、-COOH、苯环基、-OH、-SH、咪唑基、吲哚基载体：芳香氨基，羧