分子杂交和印迹技术(3-LMJ).pptxVIP

基因操作第七章GeneManipulating*1

分子印迹与杂交技术*21第四节2MolecularBlottingHybridizationTechnology3江黎明2013年10月

印迹(blotting)*3核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)指具有一定互补序列、不同来源的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷酸双链的过程。指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。Marmum和Doty1961年发现的DNA变性复性现象是核酸杂交技术的理论基础。

(heteroduplex)

一、印迹技术(blotting)*51975年EdwenSouthern建立的DNA印迹杂交。指将电泳凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定化介质如硝酸纤维素膜上并加以检测分析的技术。支持物转移缓冲液纸巾玻璃板500g（1）印迹：电转移真空负压吸引转移Whatman滤纸凝胶Whatman滤纸重物NC膜或尼龙膜毛细作用转移

（3）显示：（2）杂交：*6NC膜上载有的DNA单链分子就可以在杂交液中与另一种DNA或RNA分子(称为探针，可用同位素或非同位素标记)进行杂交。01具有互补序列的RNA或DNA标记探针结合到存在于NC膜的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现杂交分子的有无和位置。02

核酸分子杂交应用*701特定基因序列的定性和定量分析02基因克隆的筛选03酶切图谱的制作04基因突变分析05疾病的诊断

探针(probe)的概念：二、探针的种类和制备*8用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的互补标记片段：1与待测特定核苷酸的某一段序列相互补；2有明确的标志用于后续的检测。3

（一）常用探针的种类*92017探针的种类012018寡核苷酸探针022019基因组DNA探针032020cDNA探针042021RNA探针052022DNA探针06

1．DNA探针*10从克隆在质粒载体中的特异性基因片段制备；优点则是容易制备。双链探针:用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性基因片段制备；优点是在杂交反应中可以排除互补链的干扰。单链探针

2．RNA探针*1104030102早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针主要用于研究目的，而不是用于检测。如筛选HIV的基因组DNA克隆、进行中的转录分析等式。与DNA单链探针相比，RNA探针具有标记效率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点标记是在细胞基因转录或病毒复制过程，效率往往不高，且受多种因素的制约。

（二）核酸探针的标记*12根据是否使用放射性标记物可分为放射性标记和非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。理想标记物应备条件①不影响碱基对特异性④有较高的化学稳定性②检测方法高度特异、灵敏③标记及检测方法简单⑤环保，无损害⑥价格低廉

1.放射性同位素标记探针*13优点1缺点2灵敏度和特异性极高3半衰期短,随用随标4对各种酶促反应无任何影响5不影响碱基配对的特异性与稳定性6放射性污染7用于核酸探针标记的放射性同位素主要有32P、3H和35S等；32P应用最多。8

32P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。缺点是半衰期短(14.3天)，射线散射严重，放射自显影后X胶片上的信号有时边缘不清。r-32PATPa-32PdATP**3’H2’dATP

(1)DNA切口平移(nicktranslation)标记法核酸探针的标记方法*15当双链DNA一条链上产生切口时，E.coliDNA聚合酶Ⅰ的5’→3’聚合酶活性可将核苷酸连接到切口的3’羟基末端；同时，5’→3’的外切酶活性能从切口的5’端除去核苷酸。最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。在切去切口5’端核苷酸的同时又在切口的3’端补上核苷酸，可使切口沿着DNA链移动；用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。010302

DNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端。DNA切口平移标记法示意图大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’外切核酸酶活性。

使寡核苷酸随机引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。DNA随机引物标记法

DNA随机引物标记法示意图*18随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段：保留5’→3’DNA聚合酶活性,