植物病原细菌学实验课件 (2).pptVIP

三作业：1若有吲哚和硫化氢产生，其实验的试管口上的滤纸条会发生什么样的颜色变化，为什么？2在石蕊牛乳不能和其他细菌培养基一起灭菌，为什么？反应中会出现多种不同的反应，试分析其发生的原因？3观察和记录细菌氧化发酵试验、MR试验以及接触酶试验结果。第62页，共91页，星期日，2025年，2月5日实验五植物病原细菌的PCR分子鉴定?1了解PCR反应的原理；掌握PCR反应的操作方法。一、实验目的第63页，共91页，星期日，2025年，2月5日二、PCR扩增聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）第64页，共91页，星期日，2025年，2月5日1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；第65页，共91页，星期日，2025年，2月5日③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。第66页，共91页，星期日，2025年，2月5日2.分离方法A.倒平板：注意培养基的温度不能太高，否则冷凝水太多，细菌在水中游动而影响单个分散菌落的形成。（1）平板划线分离法：被普遍采用第30页，共91页，星期日，2025年，2月5日B.用接种环蘸取上述配制好的菌悬液，在已凝固的平板培养基表面划线如果菌液浓度大，培养皿转动角度减小，增加划线的次数划4条线后，将接种环灭菌，培养皿转动90°，从第2条线开始划4－5条线第31页，共91页，星期日，2025年，2月5日（2）培养皿稀释分离法0原液1取1环菌液0.5ｍL灭菌水2混匀后取1环3混匀后取1环4混匀后取1环5混匀后取1环第32页，共91页，星期日，2025年，2月5日3.培养一般放置在28－30℃温箱中倒置培养，时间2～3d。将冷却至45℃左右的培养基倒入装有稀释菌液的培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液和培养基混匀，待其凝固后培养。第33页，共91页，星期日，2025年，2月5日4.细菌的纯化挑取分离出的典型单菌落平板划线培养（2皿），如此重复1－2次，最后，在均匀一致的平板中，挑取典型菌落移植在斜面培养基上培养，长成后在4℃环境中保存菌种。第34页，共91页，星期日，2025年，2月5日1.配制107-108CFU/mL的细菌悬浮液，菌龄48小时左右；（二）致病性测定2.指示植物的选择：一般用烟草，在假单胞和黄单胞菌属上较适用。第35页，共91页，星期日，2025年，2月5日3.接种方法：用注射器将细菌液从烟草下表皮注入叶肉细胞间。用灭菌水作阴性对照，同属HR阳性的菌株作阳性对照。4.培养条件：接种后的植物应保持在25℃，相对湿度较高（85%）的条件下。5.结果观察：在24～48h表现枯斑为阳性反应，3d左右出现黄斑为阴性反应。第36页，共91页，星期日，2025年，2月5日三作业：1.简述本实验中植物病原细菌的分离步骤及其操作注意事项2.烟草过敏性反应试验能够确定细菌的致病性吗？为什么？第37页，共91页，星期日，2025年，2月5日实验三植物病原细菌的形态观察?1.了解革兰氏染色鉴定的快速鉴定方法；2.掌握革兰氏染色和鞭毛染色的方法；3.掌握细菌培养性状的描述特征。一、实验目的第38页，共91页，星期日，2025年，2月5日二、实验内容和操作方法1.结晶紫草酸铵染色（一）革兰氏染色（1）试剂A.结晶紫草酸铵染剂：溶液Ⅰ：结晶紫2.0g，酒精（95%）20mL混合溶液Ⅰ和Ⅱ，过滤，贮藏于试剂瓶中，24h后使用。溶液Ⅱ：草酸铵0.8g，蒸馏水80mL第39页，共91页，星期日，2025年，2月5日C.复染剂原液：番红O2.5g，95%酒精100mL复染剂：原液10mL，蒸馏水90mLB.鲁戈尔碘液：碘1.