第八章电泳分离技术.pptVIP

插入梳子第30页，共78页，星期日，2025年，2月5日胶凝后用夹子将玻璃夹出将封胶条轻轻撕掉第31页，共78页，星期日，2025年，2月5日旋转180度，

凹玻璃向里加缓冲液第32页，共78页，星期日，2025年，2月5日4.样品制备将0.5ml样品液，0.25ml10%SDS和0.25ml1%巯基乙醇于小试管中，置100℃水浴中煮沸3分钟后，取出冷却，然后，加入0.25ml上样缓冲液(0.05%溴酚兰+40%蔗糖溶液)，混合。取出混合样品40微升加入样品槽，每个样品重复两个。第33页，共78页，星期日，2025年，2月5日5.加样第34页，共78页，星期日，2025年，2月5日6.电泳接通电源，电流恒定为80mA，待溴酚兰指示剂移至离下端0.5cm（约3小时），切断电源，拔去插头，倒出电极缓冲液。第35页，共78页，星期日，2025年，2月5日7.剥胶注意保持胶的完整性。第36页，共78页，星期日，2025年，2月5日8染色1.染色液：考马思亮蓝G-2501.0克甲醇450ml冰醋酸100ml加H2O到1000ml9脱色1.脱色液：甲醇100ml冰醋酸100ml加H2O到1000ml第37页，共78页，星期日，2025年，2月5日电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片Mark:Myosin200000wβ-galactosidase116250Phosphorylaseb97400Serumalbumin66200Ovalbumin45000Carbonicanhydrase31000Trysininhibitor21500Lysozyme14400Aprotinin6500第38页，共78页，星期日，2025年，2月5日10凝胶（脱色之后）结果分析1、计算迁移率（Rm值）：相对迁移率=2、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的Rm值为横坐标，以相应分子量的对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋白质分子量的标准的线图。3、计算未知蛋白亚基样品的分子量：根据未知样品样的Rm值，从上述标准曲线图中即可查出其分子量。蛋白样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)第39页，共78页，星期日，2025年，2月5日3.3注意事项1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。2．丙稀酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内（4℃）保存。可贮存1～2个月。测定pH（4.9～5.2）可检查其是否失效，失效不能聚合。3．TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。4．凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低时，聚合速度减慢，必须根据实验时的温度调整3号、4号试剂的用量，以使凝胶在30min内聚合。第40页，共78页，星期日，2025年，2月5日等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的等电点进行分离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。第四节等电聚焦第41页，共78页，星期日，2025年，2月5日两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。第42页，共78页，星期日，2