抗体工程蛋白质工程 (2).pptVIP

引物设计，一般可选：①5ˊ端引物选Ig前导肽保守序列，5ˊ端引物也可选Ig分子骨架区1(FR1)的保守序列。②3ˊ端引物常选J区保守序列。构建Fab基因库，则在重链绞链区和轻链恒定区设计引物。③依据抗体基因家族保守序列设计引物。④设计多套引物分别扩增。为保证引物与模板最大的匹配，扩增出所有基因，有时尚须采用兼并引物。第62页，共99页，星期日，2025年，2月5日选用丝状噬菌体(M13、fd)，其DNA呈单链。一般在其外壳蛋白基因信号肽序列与编码成熟的蛋白序列之间插入外源基因：人Ig基因片段。用特定的限制性内切酶酶解扩增出来的cDNA，克隆进入丝状噬菌体载体中，即与外壳蛋白pⅢ或pⅧ的基因连接形成融合基因。2．噬菌体表达载体的构建第63页，共99页，星期日，2025年，2月5日一般插入后不影响表达系统功能，在此融合基因中，人Ig基因片段多位于噬菌体基因的上游5ˊ端，在细菌中可以表达。一般作用的载体都是经过改建的，即含有LacZ启动子、核糖体结合位点(SD序列)、前导肽序列(保证分泌)和多克隆位点等，其后为M13外壳蛋白(pⅢ或pⅧ)。第64页，共99页，星期日，2025年，2月5日噬菌体抗体图示第65页，共99页，星期日，2025年，2月5日3．重组噬菌体DNA导入细菌进行人Ig片段表达表达出的人Ig片段位于噬菌体外壳蛋白N端，但此融合蛋白不形成包涵体，在细菌信号肽引导下到达质周腔，Ig片段在此能自发折叠成天然状态，恢复生物活性。同时，外壳蛋白构成噬菌体外壳后，抗体分子蛋白处于其N端，分布在噬菌体表面。第66页，共99页，星期日，2025年，2月5日抗体库的构建第67页，共99页，星期日，2025年，2月5日4单链噬菌体有效筛选抗体库建立后,用可溶性抗原去筛选表达的抗体，在筛选流感病毒血凝素抗体、破伤风类毒素抗体时证明，筛选率很低。需要改进和提高产率。第68页，共99页，星期日，2025年，2月5日制备固相化抗原柱人体内是通过抗原的提呈作用，选择表面呈现特异抗体的B细胞和增殖分泌抗体的浆细胞。并在抗原选择压力下发生改变，产生出具有不同亲和力抗体。为了模拟此选择作用，在体外用固化抗原柱筛选噬菌表面抗体，再利用噬菌体能感染大肠杆菌特性，确重新感染细菌进行扩增。固相多用层析柱，也有用颗粒物质和酶联孔的。第69页，共99页，星期日，2025年，2月5日抗体库噬菌体过柱选择目的抗体把含有抗体的噬菌体培养上清加到抗原固相柱上，使表面呈现特异性抗体的噬菌体与抗原特异性结合，洗去未结合的噬菌体。此时，抗原柱吸附的带抗体的噬菌体是具有感染性,表面所带抗体是所需的特异抗体片段。显然，只要制备不同抗原柱，就可筛选到针对不同抗原的不同抗体。第70页，共99页，星期日，2025年，2月5日6．洗脱结合的噬菌体选择合适洗脱条件，把结合的、也是所需的噬菌体洗下来，收集噬菌体，再去感染细菌进行扩增。经过这样一来一轮淘筛方式，就能把抗体库中与抗原特异性结合抗体选出来，且能够做到富集。第71页，共99页，星期日，2025年，2月5日抗体库的富集筛选第72页，共99页，星期日，2025年，2月5日7．重复“吸附—洗脱—扩增”过程由于每径过一轮淘筛，可富集20～1000倍，几轮后很容易扩增到108个噬菌体体库。第73页，共99页，星期日，2025年，2月5日（二）应用1．应用“万能库”,制备人源抗体、多功能抗体不经免疫已获得许多人的抗半抗原、蛋白质、多糖及病毒等抗体。2．抗感染：传染病诊断、治疗和预防(当前重点、热点)。3．抗肿瘤：肿瘤和其他疾病的导向治疗和基因治疗。第74页，共99页，星期日，2025年，2月5日4．利用抗体信息设计药物。5．噬菌体表位文库，可用此表达系统表达特异多肽后，建立肽库（peptidelibrary）。第75页，共99页，星期日，2025年，2月5日蛋白质工程(proteinengineering）第76页，共99页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的结构及其多样性第77页，共99页，星期日，2025年，2月5日①氨基酸种类不同，肽链结构不同

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◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎蛋白质多样性原因②氨基酸数目成百上千，肽链结构不同③氨基酸排列顺序千变万化，肽链结构不同☆-☆-○-◎-

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