DBS13 008-2017 食品安全地方标准 肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法.docxVIP

DBS13

河北省地方标准

DBS13/008—2017

食品安全地方标准

肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增

（LAMP）检测方法

2017-11-08发布2018-02-01实施

河北省卫生和计划生育委员会发布

Ⅰ

DBS13/008—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009规定的格式编写。

本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。

本标准于2017年11月8日首次发布。

DBS13/008—2017

2

食品安全地方标准

肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法

1范围

本标准规定了肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测方法。

本标准适用于肉及肉制品中沙门氏菌的快速筛选检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检测总则

GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3原理

根据沙门氏菌属特有的靶序列invA基因设计的两对特殊的内、外引物和一对环引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）启动循环链置换反应，在invA基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；加入SYBRGreenI染料，即可通过颜色变化观察判定结果。

叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，PMA)染料能够嵌入细胞外DNA或者穿过非活性菌受损的细胞膜进入细胞进而嵌入其DNA内，但被阻隔在活性菌的完整细胞膜之外。嵌入非活性菌DNA的PMA染料能够在强光照射下通过叠氮基团与DNA进一步形成牢固的共价结合，使其不能在后续的LAMP反应中扩增，因而可在LAMP反应中消除来自于非活性菌的DNA对LAMP检测结果的影响。

4仪器和设备

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

4.1冰箱：2℃~5℃,-20℃;

4.2恒温培养箱：36℃±1℃,42℃±1℃;

4.3均质器；

4.4振荡器；

4.5电子天平：感量0.1g；

4.6二级生物安全柜；

4.7高速台式离心机：5000r/min~16000r/min；

4.8水浴锅或加热模块：63℃±1℃,80℃±1℃;

4.9微量移液器（0.1μL~2.5μL；0.5μL~10μL；20μL~200μL；100μL~1000μL）和吸头；

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4.10无菌透明离心管：1.5mL；

4.11PCR反应管（透明）；

4.12水浴振荡器：220r/min，37℃±1℃;

4.13卤素灯：500W。

5试剂和材料

除有特殊说明外，实验所用试剂均为分析纯或符合生化试剂标准；实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。

5.1缓冲蛋白胨水（BPW），见GB4789.4中A.1。

5.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，见GB4789.4中A.2。

5.3亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液，见GB4789.4中A.3。

5.4引物：根据沙门氏菌属特有的靶序列invA基因设计一套特异性引物，见表1。

表1特异性引物序列

引物种类

引物名称

核苷酸序列

外引物1

F3

5’-CGGCCCGATTTTCTCTGG-3’

外引物2

B3

5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’

内引物1

FIP

5’-GCGCGGCATCCGCATCAATA-TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3’

内引物2

BIP

5’-GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC-3

环引物1

LF

5’-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3’

环引物2

LB

5’-GAAAGGGAAAGC