第13章 核酸的结构与性质1.ppt

２延伸PCR原理３变性PCR原理３复性PCR原理３延伸PCR原理DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增(2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。24016256７11452228200短片段（单链)1412108642长片段（单链)128643216８４２总片段（单链)６５４３２１０循环数经过30次循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。（二）双脱氧终止法(酶法)Sanger，英国，1955确定牛胰岛素结构，1958获诺贝尔化学奖；1975设计出DNA测序法，1980获诺贝尔化学奖。dNTP参与的生物体内DNA的复制化学反应OH×ddNTP参与的生物体内DNA的复制化学反应DNA全自动测序变性（三）化学裂解法(Maxam-Gilbert，1977)1M的哌啶加热90度123454（四）RNA的测序（1）酶裂解法??胰RNaseA：嘧啶结尾（U、C）米曲霉RNaseT1：鸟苷酸结尾（G）黑粉菌RNaseU2：腺苷酸结尾（A）多头黏菌RNasePhyI：A、G、U结尾（2）化学裂解法（3）逆转录成cDNA法核酸的种类、核苷酸的种类、脱氧核苷酸和核糖核苷酸的分子区别。什么是核酸变性？变性因素有哪些？什么是核酸的解链温度Tm？影响因素有哪些？核酸退火、高色效应、减色效应、核酸分子杂交的定义。解释琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲电泳分离核酸的原理既区别？双脱氧终止法测序的原理。本章作业5-羟甲基尿嘧啶N6-甲基腺嘌呤*一）核酸的水解二）核酸的酸碱性质三）核酸的紫外吸收四）核酸的变性、复性及杂交五、核酸的物理化学性质（p245)一）核酸的水解(P245)（一）酸水解对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键脱嘌呤：pH1.6，37℃，对水透析pH2.8，100℃，1h脱嘧啶：98-100%甲酸，175℃，2h三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或80min（RNA）利用酸水解可以研究核酸的碱基组成（二）碱水解1、RNA的磷酸酯键对碱敏感室温，0.3～1mol/LKOH，24h，可将RNA完全水解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。2、DNA抗碱水解生理意义：1）DNA更稳定，遗传信息。2）RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。（三）酶水解非特异的磷酸二酯酶：牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）5’-磷酸酯键，得3’-核苷酸蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）3’-磷酸酯键，得5’-核苷酸核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，故等电点偏酸性。DNA的pI约为4～5RNA的pI约为2.0～2.5二）?核酸的酸碱性质三）核酸的紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm的紫外波段有强烈的光吸收，最大峰值在λmax=260nm1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂质蛋白，则A260/A280比值明显降低。2、含量计算1ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸1：天然DNA2：变性DNA3：核苷酸四）核酸的变性、复性及杂交(一)变性核酸变性在某些理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，DNA双链解开成两条单链的过程。不涉及共价键断裂。方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。DNA的热变性热变性：当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。解链曲线:如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。解链温度Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。影响Tm值的因素（1）溶液离子强度增高，Tm增加（2）GC含量越高，Tm越大（3）DNA越长，Tm越大DNA溶液的粘度降低浮力密度增加旋光偏振光改变紫外