单克隆抗体生产流程.pptx

单克隆抗体生产流程

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目录

CONTENTS

01

免疫抗原制备

02

杂交瘤细胞融合

03

单克隆筛选与扩增

04

抗体规模化生产

05

抗体纯化工艺

06

质量控制与应用

01

免疫抗原制备

抗原选择与设计

天然抗原、重组抗原或合成多肽。

抗原来源

高纯度抗原可提高免疫反应特异性。

抗原纯度

选择与抗体结合的关键表位，去除无关表位以降低交叉反应。

抗原结构

通过化学或生物方法修饰抗原，增强其免疫原性。

抗原修饰

实验动物免疫方案

动物种类

选择能产生高质量抗体的动物，如小鼠、兔、大鼠等。

01

免疫剂量

抗原剂量应适中，过低无法刺激免疫反应，过高则可能导致免疫耐受。

02

免疫途径

包括肌肉注射、皮下注射、腹腔注射等，根据抗原特性和动物种类选择。

03

免疫次数

多次免疫以增强免疫反应，一般需进行2-4次。

04

血清效价检测

判定标准

采用ELISA、免疫印迹等方法检测血清中抗体效价。

血清保存

检测方法

根据实验要求设定阳性对照和阴性对照，确定抗体效价的判定标准。

高效价血清需储存于适宜条件下，如-20℃冰箱，避免反复冻融。

02

杂交瘤细胞融合

脾细胞与骨髓瘤细胞制备

脾细胞制备

取免疫后的小鼠脾细胞，经过特殊处理使其成为能够与骨髓瘤细胞融合的细胞。

01

骨髓瘤细胞制备

选用能够无限增殖并易于融合的骨髓瘤细胞系，如SP2/0或NS-1等。

02

细胞悬液制备

将制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞分别用无血清培养基悬浮，并进行计数。

03

细胞融合技术选择

聚乙二醇（PEG）融合法

将细胞悬液与PEG溶液混合，使细胞膜发生融合，形成杂交瘤细胞。此方法简单易行，融合效率高。

电融合法

化学融合法

利用电脉冲使细胞膜发生短暂穿孔，促使细胞融合。此方法需特殊设备，但融合效率较高，重复性好。

使用如聚乙二醇等其他化学融合剂，通过化学作用使细胞膜融合。此方法融合效率较低，且可能对细胞产生毒性。

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杂交瘤筛选条件

特异性抗体筛选

细胞特性鉴定

抗体产量测定

利用抗原特异性筛选杂交瘤细胞，确保获得的杂交瘤细胞能够分泌针对目标抗原的特异性抗体。

通过ELISA等方法测定杂交瘤细胞培养上清中的抗体产量，筛选出高产杂交瘤细胞株。

对筛选出的杂交瘤细胞进行染色体分析、同工酶分析等，以确认其具有骨髓瘤细胞和脾细胞的特性，确保杂交瘤细胞的稳定性和抗体分泌能力。

03

单克隆筛选与扩增

有限稀释法操作

细胞悬液的制备

将杂交瘤细胞从原代培养物中分离出来，制备成细胞悬液。

02

04

03

01

培养基的选择与接种

选择适当的培养基，将稀释后的细胞悬液接种至培养皿中。

细胞计数与稀释

对细胞悬液进行计数，并将其稀释至适宜浓度。

克隆的筛选

通过有限稀释法，将单个细胞分散到培养皿中，培养并筛选出单克隆。

根据实验需求选择适当的抗体检测方法，如ELISA、RIA等。

抗体检测方法的选择

通过特定抗原与抗体的反应，验证所筛选出的抗体是否具有特异性。

抗体特异性验证

测定抗体的效价，以确定其在实际应用中的使用浓度。

抗体效价的测定

特异性抗体检测

采用连续传代培养、冷冻保存与复苏等方法，验证阳性克隆的稳定性。

阳性克隆稳定性验证

稳定性验证方法

连续培养阳性克隆，测定其抗体产生能力是否稳定。

抗体产生能力的测定

观察阳性克隆的细胞形态和生长特性，以确保其未发生不良变化。

细胞形态与生长特性观察

04

抗体规模化生产

筛选高表达抗体的杂交瘤细胞或转基因细胞系。

细胞选择

配制含有必需营养成分、生长因子和激素的细胞培养基。

培养基设计

调控温度、pH、溶解氧、细胞密度等培养条件，提高细胞生长和抗体产生效率。

培养条件优化

体外培养系统搭建

01

02

03

生物反应器参数优化

反应器类型选择

根据生产规模和工艺要求选择适当的生物反应器类型，如搅拌式、气升式、中空纤维等。

参数监控与调整

污染控制与防护

实时监测生物反应器内的温度、pH、溶解氧、细胞密度、营养物浓度等关键参数，并根据需要进行调整和优化。

采取严格的灭菌和消毒措施，防止微生物污染；同时设置污染预警系统，及时发现和处理潜在污染。

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3

细胞培养液收获策略

根据细胞生长曲线和抗体产生规律，确定最佳收获时间。

收获时间确定

采用适当的分离技术，如离心、过滤、层析等，将抗体从细胞培养液中分离出来；然后进行纯化，去除杂质和残留的培养基成分。

分离与纯化

对收获的抗体进行严格的质量检测，包括理化性质分析、生物学活性测定、纯度检测等，确保产品符合质量标准。

质量检测与评估

05

抗体纯化工艺

利用蛋白A或蛋白G对免疫球蛋白Fc段的特异性结合，将目标抗体从混合物中分离出来。

特异性强、纯度高、回收率高，且对抗体活性影响小。

温和，通常在生理pH和盐浓度下进行。

采用低pH或高盐浓度洗脱，