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杨树原生质体培养植株再生7000,000cells/gfreshleaves25000cells/ml;NH4NO3-freeMS+5?M2,4-D+0.05TDZ?M.PE:34.7%atday14第31页,共86页,星期日,2025年,2月5日杨树原生质体培养植株再生LiquidMS+5?M2,4-D;MS+10?MKTor1?MTDZ.第32页,共86页,星期日,2025年,2月5日杨树原生质体培养植株再生1/2MS第33页,共86页,星期日,2025年,2月5日将含原生质体的培养液倒入培养皿底部,使其成一薄层,封口后进行培养。1.????液体浅层培养原生质体的培养方法含原生质体的液体培养基第34页,共86页,星期日,2025年,2月5日特点:操作简单,对原生质体的损伤小;容易添加新鲜培养基和转移培养物;原生质体分布不均匀,易发生原生质体之间粘连;原生质体的位置不能固定,所以不能跟踪观察单个原生质体的生长过程。第35页,共86页,星期日,2025年,2月5日2.固体培养(平板培养)35℃左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体溶液混合,摇匀,倒入培养皿中,琼脂或琼脂糖凝固后,就成一薄层。进行平板培养时,要注意混合时培养基的温度。温度高对原生质体的伤害大;温度低,培养基凝固,原生质体与培养基不能混匀。特点:原生质体被固定,易观察、统计原生质体的分裂情况;添加新鲜培养基和转移培养物比较麻烦。含原生质体的固体培养基第36页,共86页,星期日,2025年,2月5日(1)液体浅层—固体平板培养双层培养法:培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基,再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭,还可以吸附培养物分泌的有毒物质,促进原生质体的生长和分裂。3.液体—固体结合培养固体培养基含原生质体的液体培养基第37页,共86页,星期日,2025年,2月5日(2)琼脂糖珠培养:用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基,滴在培养皿或三角瓶中,待其凝固后,再加入适量的液体培养基,进行旋转培养。也可以等含原生质体的琼脂糖培养基凝固后,用刀将其切成小块,再放入液体培养基中培养。改进了培养物的通气和营养环境,从而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团的形成。含原生质体的琼脂糖珠液体培养基第38页,共86页,星期日,2025年,2月5日在培养过程中,原生质体分裂开始以后,培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低,否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团(愈伤组织)达到1mm时,应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。第39页,共86页,星期日,2025年,2月5日第40页,共86页,星期日,2025年,2月5日三、影响原生质体培养效果的因素原生质体培养效果的好坏,也可以用植板率来衡量。1.植物材料:用于分离原生质体的植物材料对原生质体后来培养的效果影响极大。不同的植物、同一植物不同的品种,其遗传组成存在差异,原生质体的培养效果也就必然有差异。如Yamada曾用26个水稻品种的种子诱导出愈伤组织,再建立悬浮细胞培养,以悬浮细胞分离原生质体,结果只有1个品种的原生质体再生了植株。一般来说,容易培养的植物、外植体,其原生质体也容易培养,反之,亦然。草本比木本容易,幼嫩的材料比成熟的材料容易。第41页,共86页,星期日,2025年,2月5日2.?培养基(1)基本培养基:不同植物原生质体要求有不同的基本培养基。使用什么基本培养基,可以参照相应培养愈伤组织或细胞的培养基。一般认为,原生质体培养基种的大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元素浓度低。由于Ca2+影响到膜的稳定性,因此较高Ca2+浓度的对原生质体分裂有利。第42页,共86页,星期日,2025年,2月5日(2)有机成分:同培养细胞、愈伤组织相比,培养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分,如氨基酸、维生素、CW,YE,LH,CH、小牛血清等。大量的结果表明,培养基中添加谷氨酰胺有利于原生质体的分裂。(3)激素:培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。由于2,4-D促进细胞分裂能力很强,所以培养基中大都要加2,4-D。(4)条件化培养基:使用条件化培养基可以大大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。第43页,共86页,星期日,2025年,2月5日(5)培养基中的渗透压:原生质体无细胞壁,所以培养基中必
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