转基因动物与生物反应器.pptVIP

第五章

转基因动物与生物反响器;将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；

接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；

移植后的受精卵发育生长为后代，其中的局部后代其细胞中都携带有转

入的外源基因；

利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。;将特定的目的基因从某一生物体别离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物称为转基因动物〔transgeneticanimal〕。;外源目的基因的制备

外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞

选择获得携有目的基因的细胞

选择适宜的体外培养系统和宿主动物

转基因细胞胚胎发育及鉴定

筛选所得的转基因动物品系;第一节目的基因的制备;;二、目的基因的克隆;三、目的基因的转移;电穿孔法实现外源基因的转移;显微注射转基因技术;磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术;脂质载体包埋法;病毒介导的生物学方法;第二节转基因动物的方法;

基因显微注射法

胚胎干细胞移植法

反转录病毒法;一、基因的显微注射法;何为显微注射？

显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。;;通过DNA显微注射获得转基因小鼠示图;;〔一〕显微注射DNA的制备与纯化;〔二〕鼠的准备与要求;〔三〕超排卵与取卵;制定排卵程序：

(1)于第一日中午先向小鼠腹腔内注入5一l0单位的PMS；

(2)过48小时(第三天中午)腹腔内注入5—10单位的人hCG(注射后11—13小时

后排卵)；

(3)令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两周后可再

重用，但成功率下降；

(4)检查阴栓(第四日晨)；检查阴栓可判定是否受精；如已受精那么出现阴栓。;2受精卵的收集;〔四〕DNA显微注射;;;〔1〕硅烷油注入：取培养皿或外表皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡

〔厚约5mm〕；

〔2〕加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100?l为单元的小滴

数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)；

〔3〕胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中；

〔4〕DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中枯燥，

重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)，使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml；

〔5〕于临注射前把DNA样品在Eppendorf管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消

除末溶解物，防止阻塞注射管口；

〔6〕把待注射用的DNA装入注射管中；;〔7〕在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养

液，仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继

之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部；

〔8〕调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵

细胞膜内(小鼠胚卵直径约10?m)，进而继续进针再刺入任一原核内〔雄性原

核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象〕。注射针刺入细胞内进行注

射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射；

注射细胞数量越多越好；

〔9〕用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待

注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种；

〔10〕镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。;;;〔五〕体内接种;〔3〕麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)；

〔4〕剪出背肾部两侧毛，碘酒／酒精消毒；

〔5〕使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm；

〔6〕轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见

成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚

卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入

输卵管内；

〔7〕把输卵管及周围组织送回腹腔内；

〔8〕仔细紧密缝合创口，

〔9〕再令动物倒向另侧；按同