生化工程学：第10讲 沉淀法.ppt

蛋白质的溶解特性三级结构蛋白质的溶解特性图16.2蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域表16.1根据疏水性与化学性质对氨基酸的分类表亲水和疏水区域的分布和程度决定蛋白质在水相环境中的溶解度1.带电荷的和极性的氨基酸亲水性最强，疏水性最小2.小分子蛋白质比在化学上类似的大分子蛋白溶解性高3.蛋白质通过改变其结构如疏水基团暴露出来改变不溶解性蛋白质的溶解特性表16.2影响蛋白质溶解度的参数蛋白质本身的性质极性/非极性残基分布溶剂可利用度溶剂化沉淀平衡蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性遵循DEVL理论：

蛋白质胶粒间的范德华力（吸引力）和胶粒与液体界面存在的静电斥力平衡为基础蛋白质的沉淀方法1，加入中性盐2，将PH值调到IP3，加入可溶性有机溶剂4，加入非离子型亲水性聚合物5，加入聚电解质絮凝6，加入多价金属离子生物大分子在水溶液中的存状态：（1）两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系----胶体蛋白（2）蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞盐析原理1.盐析(Saltinducedprecipitation)

概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析法原理溶液中高浓度的中性盐离子有很强的水化能力，会夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的斥力失去，分子布朗运动的相互碰撞。发生凝集而沉淀析出。不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出，通常称为蛋白质的盐析。

盐析过程中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现的两种情况（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质周围的水化膜被破坏，分子之间有相斥力减小，与范德华力失去平衡，蛋白质溶解度随之下降。中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；离子强度对盐析过程的影响Cohn经验公式S—蛋白质溶解度，mol/L；I—离子强度c:离子浓度；Z：离子化合价β，Ks—常数离子完全解离的稀溶液中，上公式才能完全解析。β和Ks的物理意义β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法，称为Ks；β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析,称为β分级盐析法；其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。盐析用盐的选择在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 （Ks）磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁影响盐析的因素

（1）pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近；（2）盐析温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降；（3）溶质种类的影响：Ks和β值（4）溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；（5）蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；常用的盐析用盐#硫酸铵：溶解度大（767g/L）硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐 选用盐析用盐的几点考虑： （1）盐析作用要强 （2）盐析用盐需有较大的溶解度 （3）盐析用盐必须是惰性的 （4）来源丰富、经济注意事项温度：抗体对温度比较敏感，长时间暴露在室温可以使抗体失活，因此提取免疫球蛋白最好在2-4℃条件下进行。

等电点：蛋白质在等电点时的溶解度最低，兔IgG的等电点为pI8.0，操作时应该避开使用等电点附近的缓冲溶液。

蛋白质的浓度：蛋白质的浓度过高时，会出现欲分离的蛋白与其它蛋白质一起共沉的现象。因此蛋白质浓度应在2.5-3%为宜。浓度过高时应用PBS稀释。盐析用盐的用量选择饱和度（Saturation）的概念：以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度2.有机溶剂沉淀概念在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出（丙酮、甲醇、乙腈等）。原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引