DB32T 2608-2013 猪流行性乙型脑炎诊断技术.docxVIP

ICS65.020.30B22

备案号：40494-2014

DB32

江苏省地方标准DB32/T2608-2013

猪流行性乙型脑炎诊断技术

DiagnosticTechniquesforJapaneseEncephalitisofSwine

2013-12-20发布2014-01-20实施

江苏省质量技术监督局发布

DB32/T2608-2013

前言

为规范猪乙型脑炎诊断技术，特制定本标准。

本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》进行编制。

本标准由江苏省农业科学院提出。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准起草人：张雪寒、何孔旺、王小敏、郭容利、倪艳秀、李彬、温立斌、周俊明、俞正玉。

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DB32/T2608-2013

猪乙型脑炎诊断技术

1范围

本标准规定了猪乙型脑炎的诊断技术。

本标准规定的分离鉴定，间接免疫荧光技术和RT-LAMP法适用于本病的确诊，RT-LAMP适用于大批量样品的普查。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修订单）适用于本文件。

GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T18638流行性乙型脑炎诊断技术NY/T541动物疫病实验室检验采样方法

3流行病学诊断

3.1易感动物

多种动物可感染乙型脑炎病毒，多呈隐性感染，但可成为传染源。猪是乙型脑炎的重要传染源，不同年龄段的猪均能够感染，但临床症状有所不同。成年猪感染后可造成严重的生殖障碍。

3.2易感季节

本病的发生有明显的季节性，每年7-9月份发病率最高。

3.3传播媒介

蚊虫叮咬是乙型脑炎病毒传播的主要媒介。消灭传播媒介蚊虫是本病的主要预防措施。

4临床诊断

猪流行性乙型脑炎是一种发病率高死亡率低的繁殖障碍性传染病，临床症状为高热、沉郁或狂暴、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭和脑膜刺激症。感染乙脑病毒病猪症状主要表现为繁殖障碍:母猪表现为流产、死胎、木乃伊胎；公猪多表现为单侧睾丸炎，精液品质不良，失去配种能力。

5病理学诊断

公猪睾丸不同程度肿大，切面可见睾丸实质充血、出血，并有许多颗粒状的突起，有明显的黄色坏死灶。慢性病例睾丸内萎缩硬化，缩到如鸡蛋大，与阴囊粘连，睾丸实质大部分结缔组织化。流产母猪子宫内膜显著充血，粘膜上覆有粘稠的分泌物，膜面有少数小点状出血。子宫粘膜下组织水肿，胎盘呈炎性浸润。本死胎很少发生腐败。一般在体躯后部皮下有弥漫性水肿，全身肌肉退色，好像水煮肉。胸腔和心包常有积液，实质器官浊肿及散发小出血点。脑膜和脊髓硬膜有出血。

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DB32/T2608-2013

6病原学诊断

6.1病毒分离

6.1.1材料准备

除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682—2008的灭菌二级水。PBS，DMEM，兔抗猪乙型脑炎病毒高免血清和健康兔血清。

6.1.2病料采集

按NY/T541规定的方法采样。疑似JE病例，流产胎儿、死胎、木乃伊胎等的脑组织，以及公猪精液和猪舍蚊子等靶组织样品。将猪脑组织或蚊子（50-100只/次）分别置于研钵中，加入PBS反复研磨，直至样品研磨成匀浆、组织碎片基本消失为止。将研磨液分装于1.5mLEP管中，-70℃冰箱反复冻融3次，4℃12000r/min离心5min，取上清液，经一次性滤器（孔径0.22μm）过滤后，-70℃保存备用。公猪精液的预处理仅是省去研磨过程，其他步骤与猪脑组织或蚊子的预处理一致。

6.1.3细胞培养

取培养至单层的BHK-21细胞，用PBS洗3次后，加入过滤的病料上清液1.0～1.2mL，37℃细胞培养箱中吸附1.5h，期间每隔20min轻摇细胞瓶1次。弃上清液，用PBS洗1次后加入2%维持液，置5%CO2、

37℃细胞培养箱中培养3～5d，每天观察细胞病变（CPE）。如无CPE则于接毒后5d收毒，盲传3～5代。

6.1.4乳鼠接种

每只乳鼠脑内接种30.0μL或脑内兼腹腔各注射30.0μL过滤的病料上清，对照组脑内注射生理盐水30.0μL。每天观察小鼠精神状态2～3