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生物检材中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的液相色谱-质谱检验方法

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SF/T0172—2024

1)内标储备溶液：精密称取士的宁(或其他合适内标物)标准物质10mg置于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解并定容至刻度，配制成1.0mg/mL士的宁内标储备溶液。密封，置于冰箱中冷冻保存，有效期12个月，或采用市售标准溶液：

2)内标工作溶液：2μ/mL的内标工作溶液由符合5.1h)1)的内标储备溶液用甲醇稀释

得到。密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期3个月。

5.2仪器和设备

仪器和设备及要求如下。

a)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI。

b)电子天平：分度值≤0.1mg。

c)旋涡混合器。d离心机。

e)恒温水浴锅。

f)移液器。

6定性分析

6.1样品前处理

6.1.1检材样品

6.1.1.1体液样品

取血液(或尿液)0.5mL,加入内标工作溶液10μL,然后加入1%氢氧化钠溶液50μL,涡旋混匀，再加入乙酸乙酯3L,涡旋混匀，2500r/min离心3min,取上清液于55℃水浴中吹干，残留物用甲醇：含0.1%甲酸的20mmol/L乙酸铵缓冲溶液(体积比7:3)100μL复溶，供液相色谱-串联质谱仪分析。

6.1.1.2组织样品

称取剪碎(或匀浆后)组织0.5g,加入内标工作溶液10山，然后加入1%氢氧化钠溶液800μL,涡旋混匀，再加入乙酸乙酯3mL,涡旋混合，2500r/min离心3min,取上清液于55℃水浴中吹干，残留物用甲醇：含0.1%甲酸的20mmol/L乙酸铵缓冲溶液(体积比7:3)200L复溶，涡旋混匀后转移至1.5

mL离心管中，置于-20-C冰箱中放置30min,12000r/min离心3min,取上清液，供液相色谱-串联质

谱仪分析。

6.1.2空白样品

移取(或称取)空白血液(或尿液》0.5mL,(或相似空白组织0.5g)作为空白样品，按6.1.1.1(或6.1.1.2)的方法，与检材样品平行操作。

6.1.3添加样品

移取(或称取)空白血液(或尿液)0.5mL(或相似空白组织0.5g),添加标准物质工作溶液，配制成1ng/mL的钩吻素子、钩吻素甲和0.1ng/mL钩吻素己的添加样品，然后按6.1.1.1(或6.1.1.2)的方法，与检材样品平行操作。

6.2仪器检测

6.2.1仪器条件

6.2.1.1液相色谱条件

以下为参考条件，可根据不同品牌仪器等实际情况进行调整。

a)色谱柱：C18柱(150mm×2.1mm,5μm)或其他等效柱。

b)流动相：流动相A为含0.1%甲酸的20mmol/L乙酸铵缓冲溶液，流动相B为甲醇；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。

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c)流速：0.2mL/min

d)柱温：室温。

e)进样量：10μ

表1流动相梯度洗脱程序

时间nin

流动相A

流动相B

0

90%

10%

0.5

90%

10%

0.6

60%

40%

1.5

60%

40%

1.6

30%

70%

5.5

30%

70%

5.6

90%

10%

8.0

90%

10%

6.2.1.2质谱条件

6.2.1.2.1以下为参考条件，可根据不同品牌仪器等实际情况进行调整。

a)离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)。

b)检测方式：多反应监测(MRM)。)离子源电压：5500V。

d)碰撞气、气帘气、雾化气、辅助气均为高纯氮气，使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求。

e)去簇电压、碰撞能量优化至最佳灵敏度。

6.2.1.2.2在符合6.2.1.1和6.2.1.2的液相色谱条件和质谱条件下，目标物和内标物的质谱参数和保留时间参见表2。

表2目标物和内标物的质谱参数和保留时间

目标物

定性离子对

去族电压V

碰撞能量eY

保留时间min

钩吻素子

307.3180.2

70

65

3.8

307.370.1

61

钩吻素甲

323.470.1

80

58

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