HPLC基础高效液相基本原理和使用方法.pptVIP

是运用样品中各组份在不一样的两相中溶解、分派、吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而到达互相分离。;按色谱柱形状;HPLC基础;;HPLC的广泛应用;HPLC的流程;液相色谱对流动相的规定;液相色谱对流动相的规定;流动相的脱气;流动相脱气的目的

使色谱泵的输液精确

输液量均匀精确，并且脉动减小

保留时间及色谱峰面积的重现性提高

提高检测的性能

防止气泡引起的尖峰

基线稳定，信噪比增长

溶剂的紫外吸取本底减少

保护色谱柱

减少死体积

防止填料的氧化;流动相脱气的措施;脱气装置;流动相的保留;硅羟基;表面封端;在硅胶表面，每平方纳米约有6个硅醇基可供化学键合。由于键合基团的立体构造障碍，使这些硅醇基不能所有参与键合反应。表面覆盖度的大小（参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例），决定键合相是分派还是吸附占主导。

Partisil5-ODS表面覆盖度为98%，即残存2%的硅醇基，分派占主导。

Partisil5-ODS表面覆盖度为50%，既有分派又有吸附作用。

封尾键合相只有分派作用，如国内产品YWG-FN是用氟酰胺遮盖了硅胶的吸附部位，分离效果良好，但疏水性强。在同样分离条件下，柱压高于一般键合相柱。;颗粒度

颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)

柱压越高(渗透性差)

颗粒分布

颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差)

颗粒形状

球型:柱效高、重现性好、柱床构造均匀

无定型：柱床构造不均匀,流动相线性速度不均匀,谱带扩展;长处;重要部件;双活塞往复泵;外梯度:

运用两台高压输液泵，将两种不一样极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。;流路中为高压力工作状态，

一般使用耐高压的六通阀进样装置，

其构造如图所示：;液相色谱检测器;示差折光检测器;荧光检测器;;色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间;系统合用性;分离度方程式;W;

W σ 措施

Wtan 16 切线法

Wh 5.54 半峰高

W3σ 9 3σ

W4σ 16 4σ

W5σ 25 5σ;a;得到数据:定性及定量分析

敏捷度的规定

??品的复杂性

样品量的规定

精度及精确度的规定

轻易使用;首先用标样确定欲定量之色谱峰的保留时间(Rt)

通过比较保留时间,找到未知样中各色谱峰所对应的组份

色谱定性是用与标样比较保留时间的措施,判据并不充足

因此要明确：

保留时间相似，也许是同样的组份

保留时间不一样，肯定不是同样的组份;确认被检测组分峰,并到达分离度(R)不小于1.5

确定被测组分色谱峰的一致性(纯度)

确定措施的检测限及定量限;敏捷度及线性范围

用不一样浓度的原则样品建立校正曲线

考察定量措施的精确度及精密度

用对应的色谱管理软件实行样品采集,数据处理及汇报成果;外标法定量;采集不一样浓度标样的色谱图

积分,按外标法定量计算,建立原则曲线;无需各组份都被检出、洗脱

需要标样

标样及样品测定的条件要一致

进样体积要精确

在液相色谱中用得最多;内标法定量;采集不一样浓度标样的色谱图

积分,按内标法定量计算,建立原则曲线;无需各组份都被检出、洗脱

需要标样，需要内标样

成果与进样体积无关

精确，不过麻烦

在原则措施中用得最多;校正曲线的检测范围;与其他措施结合定性;色谱法的基本原理，简述液相色谱与气相色谱、薄层色谱、超临界流体色谱、毛细管电泳色谱在柱效、应用范围、费用等方面的不一样

按分离机制分，色谱重要可以分为哪几类，简述其重要特点。

高效液相色谱的重要部件，简述其工作原理；

高效液相色谱中对流动相的规定有哪些，简述流动相脱气处理的目的和措施。

高效液相色谱中定性和定量的措施是什么，简述内标法和外标法的操作过程及其优缺陷。