生物化学 药本 第19章药物研究的生物化学基础.ppt

二、生物药物质量控制的生化分析法

（一）多肽与蛋白质类药物的主要分析方法1.蛋白质药物的纯度分析蛋白质纯度一般是指样品有无含其他杂蛋白，而不包括盐类、缓冲液离子、SDS等小分子在内。蛋白质纯度检测方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS毛细管电泳（CE）等点聚焦（IEF）HPLC（包括凝胶排阻层析，各种反相HPLC，离子交换色谱，疏水色谱等）化学法2.多肽与蛋白质的分子量的测定3.蛋白质的定量测定4.生物质谱法（二）核酸类药物的主要分析方法核酸、核苷酸及其衍生物的分子中含有碱基，具有共轭双键结构，对紫外光有特征吸收，RNA和DNA对紫外光的特征吸收位于260nm处。核酸分子中含有碱基、戊糖和磷酸。定量核酸的方法可测定三者中任何一种，从而计算样品中的核酸含量。每1ml含1μgRNA溶液的光吸收值为0.022，每1ml含1μgDNA溶液的光吸收值为0.020。1.紫外分光光度法测定RNA与DNA含量当RNA与浓盐酸在100℃下煮沸后，即发生降解产生核糖，并进而转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应生成绿色复合物，在670nm处有最大吸收。2.地衣酚显色法测定RNA3.二苯胺法测定DNA含量（三）酶类药物的分析酶类药物的主要质量指标是它的催化活力。适宜的测定酶活力的方法至少应满足如下条件：1.有可被检测且能反映酶反应进行程度的信号物2.底物对酶远远过量3.适宜的反应温度4.最适的pH反应体系5.被测的酶量适当6.测定时间在酶促反应初速度范围内。（四）重组DNA药物中的可能杂质检查1.外源性DNA重组DNA药物中残留的外源性DNA来源于宿主细胞，每种制品都有其独特的残留DNA，因此产品中必须控制外源性DNA残留量。测定残留DNA的有效方法：DNA分子杂交技术。2.宿主细胞蛋白质宿主细胞蛋白质简称宿主蛋白，是指生成过程中来自宿主或培养基中的残留蛋白或多肽等杂质。测定制品中宿主蛋白含量的方法：酶联免疫吸附测定法（ELISA）；Westernblot法。(四)重组体的构建1.粘性末端连接：用同一种酶裂解后，产生相同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键结合，在T4DNA连接酶的作用下，共价闭合。连接方式：定向取代双向插入（正向/反向）（双酶切）（单酶切）措施：载体酶切后，用AP（碱性磷酸酶）水解5’端的磷酸基团防止载体的自身环化。同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接GGATCCCCTAGGBamHⅠ的识别序列及切割部位GGATCCCCTAGGBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGCCTAG535335535353GGATCCCCTAGGGATCCG目的基因片段混合、退火GCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAG质粒载体含目的基因的重组质粒GCCTAGGATCCGDNA连接酶双酶切DNA片段粘性末端的连接GGATCCCCTAGGBamHⅠBamHⅠBamHⅠGCCTA