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γ-氨基丁酸检测方法的比较

徐慧慧;章益明;梁新珍

【摘要】本文对检测γ-氨基丁酸的纸层析法、高效液相色谱法和氨基酸分析仪法进行了全面的比较研究.结果表明纸层析法检测γ-氨基丁酸,在使用展开剂V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=4∶1∶3的条件下,具有简单、快速等优点,但精密度较低.高效液相色谱法以邻苯二甲醛作为衍生剂,用反相C18柱为分离柱,精密度较高,准确度较好,但是操作过程相对繁琐.氨基酸分析仪法采用茚三酮柱后衍生,稳定性好、灵敏度高、操作简便,但要求样品氨基酸浓度在100nmol/mL范围内,使用费用高.

【期刊名称】《发酵科技通讯》

【年(卷),期】2014(043)003

【总页数】5页(P37-41)

【关键词】γ-氨基丁酸;纸层析法;高效液相色谱法;氨基酸分析仪

【作者】徐慧慧;章益明;梁新珍

【作者单位】浙江新和成股份有限公司,浙江新昌,312500;浙江新和成股份有限公司,浙江新昌,312500;浙江新和成股份有限公司,浙江新昌,312500

【正文语种】中文

γ-氨基丁酸又名4-氨基丁酸（4-aminobutyricacid）和γ-氨酪酸，简称GABA，是一种天然活性成分，广泛分布于动植物体内。其分子式为C4H9NO2，相对分子量为103.2，结构式如图1。

图1GABA结构式

GABA是一种抑制性神经传递物质，具有重要的生理活性，如：抗焦虑[1]，降血压[2]，治疗癫痫[3]，改善睡眠[4]，抗衰老[5]，调节激素分泌[6]及神经营养[7]等。GABA已成为一种新型功能性因子，正广泛应用于食品、医药和化工等领域。GABA可以用化学合成法生产，也可以以植物富集法、微生物发酵法生产。

从产品质量检测角度考虑，GABA测定方法的可靠性和准确性至关重要。关于GABA的测定方法有很多种，如纸电泳法、纸层析法、比色法、高效液相色谱法和氨基酸分析仪测定法等，它们具有各自的优缺点。本实验以产GABA微生物发酵液为样本对GABA的测定方法进行了比较研究，确定了纸层析定性测定与高效液相色谱法定量测定GABA相结合的方法，优化了HPLC的条件和参数。此法方便可行，准确率较高。

1材料和方法

1.1主要试剂

分析纯试剂：无水乙酸钠、正丁醇、冰醋酸、硼酸、三乙胺、OPA（邻苯二甲醛）、β–巯基乙醇、茚三酮、谷氨酸钠、磺基水杨酸。

γ–氨基丁酸（纯度99%）购于杭州迈瑞化工仪器有限公司。

色谱纯试剂：甲醇、乙腈。

1.2主要溶液

1.2.1纸层析用溶液

(1)不同展开剂

V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=4:1:3；4:1:1；4:2:1；2:1:1；5:3:2；3:2:1

(2)茚三酮溶液

1.5g茚三酮+100mL正丁醇+3.0mL醋酸

(3)γ–氨基丁酸标准溶液

准确称量100mg标准γ–氨基丁酸，用超纯水溶解后定容于100mL容量瓶，得1g/L的γ–氨基丁酸标准液，倒入试剂瓶，4℃冷藏备用。其它浓度的γ–氨基丁酸标样在使用时由该标准液稀释而成。

1.2.2高效液相色谱法用溶液

(1)衍生化试剂配制：将OPA10mg，β–巯基乙醇10μL溶于2.5mL乙腈。

(2)0.4mol/L硼酸缓冲液（pH=10.4）：取硼酸2.47g，溶于100mL超纯水，调pH=10.4。

(3)0.02mol/L醋酸钠缓冲液（pH=7.2）：取乙酸钠1.64g溶于1000mL超纯水，加入三乙胺180μL，调pH=7.2。

1.3实验方法

1.3.1发酵液γ-氨基丁酸的定性测定

发酵液离心除菌样品经纸层析分离、显色后，不同氨基酸色斑的Rf值不同，因此可根据Rf值大小定性判断。具体方法如下：

(1)点样：将滤纸裁成适当大小，宽度大约为15～20cm，长度依据样品的个数来决定，用铅笔在距底边2cm的地方划一道直线（称为原线），线上每隔1cm标上一个点，写上点样标记，然后用移液枪吸取2μL发酵液的上清液，轻轻点在纸上标记的位置；取1g/L的γ–氨基丁酸标样和谷氨酸钠标样点样，作标准样对照。点样时应保持滤纸洁净。

(2)展开：在层析缸上端悬挂一条线，将展开剂倒入层析缸中，溶液高度约为1cm，然后将滤纸点有样品的一端缓缓放入缸内的展开剂中并把滤纸悬挂于线上，滤纸应避免接触层析缸内壁，纸的底部应平行浸于展开剂中。

(3)显色：展开3h后，取出滤纸并用吹风机将其吹干，再向滤纸上喷洒茚三酮溶液，吹干后，放于70℃电热鼓风箱中显色5min。

1.3.2高效液相色谱法测定γ-氨基丁酸

(1)样品预处理：用50g/L的三氯乙酸稀释发酵液上清液至适当浓度，以0.45μm的滤膜过滤待测。

(2)样品衍生：吸取400μL硼酸缓冲液，80μL样品溶液和OPA衍生试剂160μ