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生物化学实验——糖酵解中间产物的鉴定

一、实验目的

了解糖酵解过程的某一中间步骤及利用抑制剂来研究中间代谢的方法。

二、实验原理

利用碘乙酸对糖酵解过程中3-磷酸苷油醛脱氢酶的抑制作用，使3-磷酸苷油醛不再向前变化而积累。硫酸肼作为稳定剂，用来保护3-磷酸苷油醛是不自发分解。然后用2，4-二硝基苯肼与3-磷酸苷油醛在碱性条件下形成2，4-二硝基苯肼-丙糖的棕色复合物，其棕色程度与2-磷酸苷油醛含量成正比。

三、仪器原料和试剂

（1）仪器：试管（1.5×1.5cm）、吸量管（1ml、、2ml3ml）、恒温水浴、烧杯（50ml）。

（2）原料：新鲜酵母。

（3）试剂：

①2，4-二硝基苯肼：0.1g2，4-二硝基苯肼溶于水100ml2mol/L盐酸溶液中，贮于棕色瓶中备用。

②0.56mol/L硫酸肼溶液：称取7.28g硫酸肼溶于50ml水中，这时不会全部溶解，当加入NaOH使pH达7.4时则完全溶解。此液也可用于水合肼溶液配制，可按其分子浓度稀释至0.56mol/L，此时溶液呈碱性，可用浓硫酸调pH至7.4即可。

③5%葡萄糖溶液。

④10%三氯乙酸溶液。

⑤0.75mol/LNaOH溶液。

⑥0.002mol/L碘乙酸溶液。

四、操作步骤

（1）取小烧杯3只，分别加入新鲜酵母0.3g，并按下表分别加入各试剂，混匀。

杯号

5%葡萄糖加入量/ml

10%三氯醋酸加入量/ml

碘乙酸加入量/ml

硫酸肼加入量/ml

发酵时起泡多少

1

10

2

1

1

2

10

--

1

1

3

10

--

--

--

（2）将各杯混合物分别倒入编号相同的发酵罐内，放入37℃保温1.5h，观察发酵管产生气泡的量有何不同。

（3）把发酵管中发酵液倾倒入同号小烧杯中并在2号和3号杯中按下表补加各试剂，摇匀放10min后和第一只烧杯中内容物一起分别过滤，取滤液进行测定。

杯号

10%三氯乙酸/ml

碘乙酸/ml

硫酸肼/ml

2

2

--

--

3

2

1

1

（4）取3个试管，分别加入上述滤液0.5ml，并按下表加入试剂和处理。

管号

滤液/ml

0.75mol/L

NaOH/ml

室温放置

10min

2，4-二硝基苯肼/ml

38℃水浴保温19min

0.75mol/L

NaOH/ml

观察结果

1

0.5

0.5

0.5

3.5

2

0.5

0.5

0.5

3.5

3

0.5

0.5

0.5

3.5

五、思考题

实验中哪一发酵管生成的气泡最多？哪一管最后生成的颜色最深？为什么？