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实时荧光定量PCR原理和实验

这一结论可以从数学上严格证明。为使表达式简便，以下推导忽略pcr效率等细节。如果考虑这些因素，可以在方程上增加修正项。这些修正项的增加并不改变方程的线性性质。一般，我们有rn=rb+xo(1+ex)nrs,也就是说第n次pcr循环时的荧光信号强度(rn)等于背景信号强度(rb)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，rs)与分子数目的乘积。当循环次数n=ct时，则有rt=rb+xo(1+ex)ctrs。两边取对数，得log(rt-rb)=logx0+ctlog(1+ex)+logrs。整理此式，ctlog(1+ex)=-logx0+log(rt-rb)-logrs.

因此，对于每个特定的PCR反应，ex、RT、Rb和RS是常数，因此CT值与logx0成反比，也就是说，CT值与初始模板拷贝数（x0）的对数成反比，并且每次初始DNA浓度增加，CT值都会减少一个周期。基于CT值的量化是准确和严格的，而传统的终点量化是广泛的。

如果读者有兴趣的话，也可以假设pcr的效率(即ex)为100%，从上式推算出定量pcr标准曲线的最佳斜率和ct值的最佳范围。

3如何确定CT值？

实验操作中，ct值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的pcr循环次数（图2）。“基线上方”也就是阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。阈值所在的横线与pcr扩增曲线的交点所指的pcr循环次数就是ct值。基线范围的定义是从第3个循环起到ct值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般取第3到第15个循环之间。早于3个循环时，荧光信号很弱，扣除背景后的校正信号往往波动比较大，不是真正的基线高度；而在ct值前3个循环之内，大多数情况下荧光信号已经开始增强，超过了基线高度，都不宜当作基线来处理。

图2ct值和阈值

显然，ct值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，ct值是一个完全客观的参数。ct值越小，模板dna