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单克隆抗体研制最详细步骤

单克隆抗体的研制

一、单克隆抗体的概念

抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制

备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗

原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定

簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原

决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常

规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonalantibody），简称多抗。由于常规抗体的多克

隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来

许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免

疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小

鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这

种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速

增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到

来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原

决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonalantibody），简称单抗。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术

的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获

得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。

Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。

二、杂交瘤技术

（一）杂交瘤技术的诞生

淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，

抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生

机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、

细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein

在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”

（）的著名

论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟

嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）的

骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交

细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺

嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体

里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只

能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓

瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得

到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培

养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红

细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交

瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。

这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台

病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污

染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653

和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，

只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再

后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是

一样的。

（二）基本程序和方法

杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作