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禽流感病毒中和实验及其他方法

（一）实验材料

1、中和反应实验材料

(1)病毒：

一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID）的滴定。

50

(2)血清样品

包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。人血清实验前需要56℃30分钟灭活，

动物血清需RDE处理。－20℃储存，避免多次反复冻融。

(3)MDCK细胞和细胞培养试剂

1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞）

2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌

500毫升DMEM（修饰的Eagles培养基）

5.5毫升100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素）

5.5毫升100×L－Glutamine（2毫摩尔）

25.5毫升56℃、30分钟加热灭活的牛血清

3)胰酶/EDTA

(4)其它

1)平底96孔微量培养板

2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。

429毫升DMEM

66毫升7.5%牛血清白蛋白（BSA）

5毫升100×抗生素

3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升）

4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存

400毫升丙酮

100毫升PBS，PH7.2

2、ELISA实验材料

(1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体

(2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG

(3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－20

4升PBS，PH7.2

2毫升TWEEN－20

(4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20

867毫升PBS，PH7.2

132毫升牛血清白蛋白

1毫升TWEEN－20

(5)底物和底物溶液：

常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用底物为磷苯二胺（OPD）

底物溶液为PH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液（0.05M）

底物和底物溶液：10毫克OPD

20毫升柠檬酸缓冲液（含0.015%双氧水）

即配即用

磷酸盐－柠檬酸缓冲液，PH5.0

58.8克柠檬酸三钠

1升蒸馏水

用盐酸调节PH为5.0

加0.015%双氧水，（临用前加入）

*如果使用磷酸盐－柠檬酸缓冲液胶囊（Sigma）1个胶囊加入100毫升

蒸馏水，临用前配制

(6)终止反应液：1N硫酸（28毫升浓硫酸+1升蒸馏水）

3、其他

细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义）

备注：A.以上实验材料购自Gibco,，Hyclone，Dynatech，KirkegaardPerry和Sigma

公司，材料编号（CAT#）参照英文讲义。

B.实验材料的配制，例如0.25%的胰酶等，请参照黄桢祥主编的医学病毒学基础及实

验技术一书。

（二）质量控制

病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清

和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和实验的结果。因此，对中和实验的整个过

程进行严格的质量控制。每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对

照，以及对病毒使用剂量进行滴定。

1、血清对照

血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含

有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对