《医学分子生物学》讲义 物理图绘制.ppt

*原位杂交技术的发展放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率的要求。荧光标记技术、强信号荧光物质的发现和重标记技术的发明，降低了对探针长度的要求。*杂交探针非特异位点的封闭*原位杂交的分辨率与染色体的制备中期染色体分辨率1000kb，主要用于发现新的分子标记属于哪条染色体；机械伸展的中期染色体分辨率200—300kb；非中期染色体分辨率可达到25kb以下。用特殊技术制备的纯化DNA可以进行纤维-FISH，分辨率可达到10kb以下。*限制性酶切作图和FISH的局限限制性酶切作图快速、简便，能提供详细定位信息，但不能用于大基因组。FISH可以用于大基因组，但难于操作，数据积累慢，一次实验定位的标记不超过3-4个。*3.4辐射杂种作图构建大基因组物理图主流技术序列标签位点（Sequencetaggedsite,STS）:指一段已知序列，通常长度在100-500bp，易于识别,在待研究的染色体或基因组中仅有一个拷贝。序列已知，方便PCR检测;在染色体上的位置独一无二。*①表达序列标签（expressedsequencetag,EST)：来源于cDNA克隆的小段序列。EST来自单拷贝

的基因时可作为STS；②SSLP：具有多态性且通过连锁分析进行定位的

SSLP，可以建立遗传图与物理图之间的联系；③随机基因组序列：可通过对克隆的基因组DNA

随机测序获得，或者从数据库中寻找。*序列标签位点作图：通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因组的DNA区段中。**①辐射杂种（radiationhybrid)：含有其他生物染色体片段的啮齿类动物细胞。②辐射杂种群（radiationhybridpanel)：通过放射杂交产生的融合细胞群称为辐射杂种群。③辐射杂种群分为两类：全基因组辐射杂种群单染色体辐射杂种群*全基因组辐射杂种的筛选使用不能产生胸苷激酶（TK)或者次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT)的仓鼠细胞系作受体。这种细胞在添加了次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基（HAT）中不能存活。只有获得人体DNA中TK和HPRT基因的仓鼠细胞才能在HAT选择性培养基中生长。*辐射杂种*单染色体辐射杂种群构建：用x射线照射另外一类含一条人染色体

的啮齿类（如小鼠）细胞系，再将这

种细胞与仓鼠细胞融合。筛选：用人类基因组广泛分布的重复序列如

Alu做探针，筛选只含有人染色体片段

的杂种细胞。*单染色体辐射杂种*使用PCR方法鉴定STS时，不会从仓鼠基因组或者小鼠基因组扩增出相应的片段。STS作图作图试剂（mappingreagent)：STS作图过程中用到的可覆盖待研究的染色体或基因组的DNA片段。辐射杂种作图的单位厘镭（centiRay,cM)：DNA分子暴露在NradX射线剂量下，两个分子标记之间发生1%断裂的频率。*人类21号染色体辐射杂种物理图*染色体物理长度（Mb）cM/cRkb/cR平均滯留率（范围）————————————————————————————12630.2019721.1(14.3-50.6)22550.2122523.8(14.3-37.5)32140.2723326.9(14.3-41.1)42030.2825624.3(11.3-44.0)51940.2927226.9(17.3-49.4)6183